هذا البروتوكول مهم لأن وجود الخلايا الجذعية السرطانية قد يكون مرتبطا مع الانتكاس أو نتيجة سيئة بعد العلاج الإشعاعي. دراسة الخلايا الجذعية الراديو ريسستانت قد توفر أدلة للتغلب على رادريستينس. في هذه التقنية ، يتم املاح الخلايا الجذعية السرطانية مع علامات وضعية عن طريق تدفق cytometry والقدرة على التجديد الذاتي للخلايا المملحة يتم تقييمها عن طريق قياس تشكيل الكرة.
يتم إجراء فحص القولون لتقييم حساسية الراديو للخلايا المملحة. وهو يحدد عدد الخلايا التي فقدت قدرتها على توليد التوليف الذي يشكل المستعمرة بعد جرعة معينة من الإشعاع. تقدم هذه المخطوطة الخطوات القليلة الأولية لدراسة الحساسية الإشعاعية للخلايا الجذعية السرطانية، والتي تضع الأساس لدراسة آلية أكمل.
قد تشمل دراسة الآلية البروتينات المتعلقة بإصلاح الضرر بالحمض النووي، وتطهير أنواع الأكسجين التفاعلية، واعتقال دورة الخلايا، وما إلى ذلك. وسوف توفر رؤى هامة في كيفية الخلايا الجذعية السرطانية الحصول على المقاومة الإشعاعية وكيفية التغلب على المقاومة. إثبات إجراء الإشعاع سيكون تشن نان لي، فني إشعاع من قسمنا.
لبدء هذا الإجراء، والخلايا A549 ثقافة في دورة 1640- 1640 المتوسطة تكملها 10٪ FBS في 10 أطباق سنتيمتر في 37 درجة مئوية، مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون. عندما تصل الخلايا إلى التقاء 80 إلى 90٪، قم بإزالة الوسيطة الخاصة بالثقافة. غسل الخلايا لفترة وجيزة مع ثلاثة ملليلتر من برنامج تلفزيوني.
بعد ذلك، إضافة ثلاثة ملليلتر من 0.05٪ التربسين إلى كل طبق. إزالة التربسين وترك التربسين residuary لهضم الخلايا في 37 درجة مئوية لمدة دقيقة إلى ثلاث دقائق. تحقق من انفصال الخلايا بشكل متكرر لتجنب الإفراط في الهضم.
عندما تصبح الخلايا فضفاضة وتبدأ في الانفصال عن الأطباق، إضافة ثلاثة ملليلتر من 1640- 1640 دورة في الدقيقة المتوسطة تكملها 10٪ FBS ونقل تعليق الخلايا إلى أنبوب 50 ملليلتر. أجهزة الطرد المركزي في 300 مرة ز و4 درجات مئوية لمدة خمس دقائق. تجاهل افراط وإعادة تعليق الخلايا في 10 ملليلتر من برنامج تلفزيوني.
نقل 0.5 ملليلتر من تعليق الخلية إلى أنبوب جديد كتحكم في النمط الأيزونمطي. أجهزة الطرد المركزي على حد سواء التحكم والأنابيب التجريبية في 300 مرة ز وأربع درجات مئوية لمدة خمس دقائق. تجاهل المُنَاتس الخارقين.
ثم، وتمييع كل من الفلورسنت ثنائي التحكم isotype والأجسام المضادة في برنامج تلفزيوني إلى التركيز الأمثل الثدي لإعداد حل العمل. إعادة تعليق السيطرة والخلايا التجريبية مع كل حل العمل ومزيج بلطف. احتضان العينات في الظلام وفي درجة حرارة الغرفة لمدة 30 إلى 40 دقيقة.
غسل الخلايا عن طريق إضافة 10 ملليلتر من برنامج تلفزيوني، وخلط بلطف، وslyruging في 300 مرة ز وعلى أربع درجات مئوية لمدة خمس دقائق. تجاهل supernatants وإعادة تعليق الخلايا مع 10 ملليلتر من برنامج تلفزيوني. بعد ذلك، ضع 40 مصافي خلايا ميكرومتر على أنابيب جديدة 50 ملليلتر، مع التأكد من إعداد أنبوب منفصل وإعداد مصفاة للسيطرة والخلايا التجريبية.
تطبيق كل تعليق الخلية على مصفاة كل منها وجمع flowthrough. الطرد المركزي من خلال تدفق في 300 مرة ز و4 درجات مئوية لمدة خمس دقائق. تجاهل افراط و resuspend الخلايا مع 0.2 إلى 1.0 ملليلتر من برنامج تلفزيوني ونقل كل تعليق الخلية في أنبوب منفصل خمسة ملليلتر لعملية استئصال الخلايا تدفق.
في خزانة السلامة البيولوجية، إعداد واحد ستة لوحة جيدا لكل جرعة الإشعاع، بما في ذلك المجموعة الرمادية صفر. إضافة 1.5 ملليلتر من وسائل الإعلام 1640 الانتهاء إلى كل بئر. تمييع الخلايا المقطوعة مع الانتهاء 1640 وسائل الإعلام إلى كثافة الخلية من 1،000 خلية في المليلتر.
ثم، إضافة تعليق الخلية المخففة إلى الآبار وتهز لوحات أفقيا لتوزيع الخلايا بالتساوي في الآبار. سجل حجم المضافة في كل مجموعة جرعة. ثقافة في 37 درجة مئويّة مع 5٪ ثاني أكسيد كربون.
بعد أن تعلق الخلايا على الجزء السفلي من الآبار، إضافة الانتهاء 1640 وسائل الإعلام إلى كل بئر حتى ارتفاع وسائل الإعلام تصل إلى سنتيمتر واحد. عندما يتم نقل لوحات بين غرفة ثقافة الخلية وغرفة العلاج الإشعاعي، والتفاف لوحات مع رقائق الألومنيوم أو وضعها في صندوق نظيف لتجنب التلوث. عقد لوحات مسطحة لتجنب تسرب المتوسطة.
بعد ذلك، تعيين في 20 سم في 20 سم حقل الإشعاع. وضع bolة مكافئة من الأنسجة 1.0 سم سمك على الأريكة العلاج ووضع لوحة ستة جيدا على bolus لإبقائهم في اتصال. تأكد من أن اللوحة كلها داخل مجال الإشعاع.
تعيين المسافة مصدر الجلد كما 100 سم وضبط ارتفاع الأريكة العلاج لمحاذاة مستوى السطح المتوسط إلى مستوى الليزر. تسليم الجرعة المخصصة لكل لوحة في تسلسل. بعد هذا، خذ اللوحات إلى مجلس الوزراء السلامة البيولوجية في غرفة ثقافة الخلية.
استبدال المتوسطة في كل بئر مع مليلتر اثنين من 1640 المتوسطة المكتملة. ثقافة في 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون، مع التأكد من تغيير المتوسطة كل ثلاثة إلى خمسة أيام. بعد سبعة إلى 10 أيام من الإشعاع، قم بإزالة الوسط وغسل الخلايا لفترة وجيزة باستخدام PBS.
في غطاء الدخان، إضافة ملليلتر واحد من 4٪ الفورمالديهايد إلى كل بئر لإصلاح الخلايا لمدة 10 دقائق. ثم، إزالة الفورمالديهايد وغسل كل بئر مرتين باستخدام مليلترين من الماء المقطر لكل غسل. إضافة ملليلتر واحد من 1٪ حل البقع البنفسجية الكريستال لكل بئر وصمة عار لمدة 10 دقائق.
بعد ذلك، قم بإزالة محلول البقع البنفسجية الكريستالي وغسل الخلايا ثلاث مرات بالماء المقطر. إزالة الماء والسماح للوحات الهواء الجافة لمدة 30 دقيقة. عد عدد المستعمرات مع أكثر من 50 خلية.
في هذه الدراسة، يتم فرز كل من ألفا اثنين دلتا واحد عالية وألفا اثنين دلتا واحد الخلايا A549 منخفضة. قد تظهر بعض العلامات مجموعات سكانية متميزة وسهلة الوصول إلى البوابة. ومع ذلك، تظهر بعض العلامات فقط أنماط التعبير العالية والمنخفضة، بدلاً من مجموعات سكانية إيجابية وسلبية مميزة.
في هذه الحالة، عنصر تحكم isotype مهم جداً لـ gating. يتم التحقق من صحة تعبير ألفا اثنين دلتا واحد في الخلايا المفجوزة بواسطة qPCR. التعبير عن CACNA2D1، الجين الذي يشفّر ألفا اثنين دلتا واحد، هو أعلى في فرز ألفا اثنين دلتا واحد خلايا عالية مقارنة مع ألفا اثنين دلتا واحد الخلايا المنخفضة.
يظهر الشكل النموذجي للمجالات وكفاءة تكوين الكرة هنا. ألفا اثنين دلتا واحد خلايا عالية تظهر كفاءة أعلى تشكيل المجال، مما يشير إلى قدرة أعلى للتجديد الذاتي. وتظهر هنا صور نموذجية للمستعمرات ومنحنيات البقاء على قيد الحياة.
يمكن فحص مستعمرة بها حوالي 50 خلية تحت المجهر ووضع علامة عليها كمرجع. يتم حساب عدد المستعمرات ، ثم يمكن حساب جزء من البقاء على قيد الحياة في كل جرعة ويمكن رسم منحنى البقاء على قيد الحياة. ألفا اثنين دلتا واحد خلايا عالية مقاومة نسبيا للإشعاع مقارنة ألفا اثنين دلتا واحد الخلايا المنخفضة.
وينبغي أن يتم تنفيذ أي خطوات تتعلق بثقافة الخلية في مجلس الوزراء السلامة البيولوجية أو مقاعد البدلاء النظيفة laminar. لتجنب التلوث ، يوصى بإضافة المضادات الحيوية إلى الوسط الثقافي بعد الفرز. عندما يتم تحديد علامة الخلايا الجذعية السرطان المفترضة مبدئيا من قبل تحليل تشكيل المجال، ويمكن إجراء مزيد من التوصيف في vivo الحد من مُقايسة التخفيف لتقييم القدرة الورمية.
من دراسة آلية من شعاعية ا أطيق، يمكن للباحثين فحص البروتين المتصلة إصلاح الضرر الحمض النووي، وإزالة أنواع الأكسجين التفاعلية، ودورة الخلية اعتقال استجابة للإشعاع. أثناء إشعاع الخلية، يرجى ملاحظة أنه لا يمكن تشغيل المسرع الخطي إلا من قبل فنيين مؤهلين. الابتعاد عن الإشعاع.
أثناء الوقوف، يرجى ملاحظة أن الفورمالديهايد متقلبة وخطرة. استخدام الفورمالديهايد في غطاء الدخان.
