Este protocolo es significativo porque la presencia de células madre cancerosas puede estar asociada con una recaída o un mal resultado después de la radioterapia. El estudio de las células madre radiorresistentes puede proporcionar pistas para superar la radiorresistencia. En esta técnica, las células madre cancerosas se salan con marcadores putativos por citometría de flujo y la capacidad de auto-renovación de las células saladas se evalúa mediante un ensayo de formación de esferas.
El ensayo de formación de colonias se realiza para evaluar la radiosensibilidad de las células saladas. Determina cuántas células perdieron su capacidad para generar la síntesis que forman la colonia después de una cierta dosis de radiación. Este manuscrito proporciona los primeros pasos para el estudio de radiosensibilidad de las células madre cancerosas, que establece la base para el estudio del mecanismo más completo.
El estudio del mecanismo puede incluir proteínas relacionadas con la reparación del daño del ADN, aclaramiento de especies reactivas de oxígeno, detención del ciclo celular, etc. Proporcionará información importante sobre cómo las células madre cancerosas obtienen radiorresistencia y cómo superar la resistencia. Demostrando el procedimiento de radiación será Chen-Nan Li, un técnico de radiación de nuestro departamento.
Para comenzar este procedimiento, cultivo de células A549 en el medio RPMI-1640 complementado con 10%FBS en platos de 10 centímetros a 37 grados Celsius, con 5% dióxido de carbono. Cuando las células alcancen 80 a 90%confluencia, elimine el medio de cultivo. Lave brevemente las células con tres mililitros de PBS.
A continuación, agregue tres mililitros de 0,05% de trippsina a cada plato. Retire la tripina y deje la trippsina residuaria para digerir las células a 37 grados Celsius durante uno a tres minutos. Compruebe el desprendimiento de las células con frecuencia para evitar la digestión excesiva.
Cuando las células se aflojen y comiencen a desprenderse de los platos, agregue tres mililitros de RPMI-1640 medio complementado con 10%FBS y transfiera la suspensión de las células a un tubo de 50 mililitros. Centrifugar a 300 veces g y a cuatro grados centígrados durante cinco minutos. Deseche el sobrenadante y resusppend las células en 10 mililitros de PBS.
Transfiera 0,5 mililitros de la suspensión celular a un tubo nuevo como control de isotipo. Centrifugar los tubos de control y experimentales a 300 veces g y cuatro grados centígrados durante cinco minutos. Deseche los sobrenadantes.
A continuación, diluir tanto el control de isotipo diconjugado fluorescente como el anticuerpo en PBS a la concentración óptima valorada para preparar la solución de trabajo. Resuspender las células de control y experimental con cada solución de trabajo y mezclar suavemente. Incubar las muestras en la oscuridad y a temperatura ambiente durante 30 a 40 minutos.
Lavar las células añadiendo 10 mililitros de PBS, mezclando suavemente y centrifugando a 300 veces g y a cuatro grados centígrados durante cinco minutos. Deseche los sobrenadantes y resusppend las células con 10 mililitros de PBS. A continuación, coloque los coladores celulares de 40 micrómetros en los nuevos tubos de 50 mililitros, asegurándose de preparar una configuración de tubo y colador separada para las células de control y experimentales.
Aplique cada suspensión celular sobre el colador respectivo y recoja el flujo a través. Centrifugar el flujo a través de 300 veces g y a cuatro grados Celsius durante cinco minutos. Deseche el sobrenadante y resuspendir las células con 0,2 a 1,0 mililitros de PBS y transfiera cada suspensión celular a un tubo separado de cinco mililitros para la citometría de flujo.
En un gabinete de seguridad biológica, prepare una placa de seis pozos para cada dosis de radiación, incluido el grupo gris cero. Agregue 1,5 mililitros de medios 1640 completados a cada pozo. Diluir las células cosechadas con 1640 medios completados a una densidad celular de 1.000 células por mililitro.
Luego, agregue la suspensión celular diluida a los pozos y agite las placas horizontalmente para distribuir uniformemente las células en los pozos. Registre el volumen añadido en cada grupo de dosis. Cultivo a 37 grados centígrados con 5% de dióxido de carbono.
Después de que las células se hayan unido a la parte inferior de los pozos, agregue 1640 medios completos a cada pozo hasta que la altura del medio alcance un centímetro. Cuando las placas se transfieran entre la sala de cultivo celular y la sala de radioterapia, envuelva las placas con papel de aluminio o colóquelas en una caja limpia para evitar la contaminación. Sujete las placas planas para evitar que se derramen en el medio.
A continuación, establecido en un campo de radiación de 20 centímetros por 20 centímetros. Coloque un bolo equivalente al tejido de 1,0 centímetros de grosor en el sofá de tratamiento y coloque la placa de seis pozos en el bolo para mantenerlos en contacto. Asegúrese de que toda la placa esté dentro del campo de radiación.
Establezca la distancia de la piel de origen como 100 centímetros y ajuste la altura del sofá de tratamiento para alinear el nivel de superficie medio con el nivel del láser. Proporcione la dosis asignada a cada placa en secuencia. Después de esto, lleve las placas al gabinete de bioseguridad en la sala de cultivo celular.
Sustituya el medio de cada pozo por dos mililitros de 1640 medio completado. Cultivo a 37 grados centígrados con 5% de dióxido de carbono, asegurándose de cambiar el medio cada tres a cinco días. De siete a 10 días después de la radiación, retire el medio y lave brevemente las células con PBS.
En una campana de humo, agregue un mililitro de 4%formaldehído a cada pozo para fijar las células durante 10 minutos. A continuación, retire el formaldehído y lave cada pozo dos veces con dos mililitros de agua destilada para cada lavado. Añadir un mililitro de 1%Cristal de solución de manchas violetas a cada pozo y manchar durante 10 minutos.
Después de esto, retire la solución de manchas violetas de cristal y lave las células tres veces con agua destilada. Retire el agua y deje que las placas se sequen al aire durante 30 minutos. Cuente el número de colonias con más de 50 células.
En este estudio, se ordenan las dos células alfa dos delta uno alto y alfa dos delta una baja A549. Algunos marcadores pueden mostrar poblaciones distintas y son fáciles de cercar. Sin embargo, algunos marcadores solo muestran patrones de expresión altos y bajos, en lugar de poblaciones positivas y negativas distintivas.
En esta situación, un control de isotipo es muy importante para el gating. La expresión de alfa dos delta uno en celdas ordenadas es validada por qPCR. La expresión de CACNA2D1, el gen que codifica alfa dos delta uno, es mayor en alfa clasificado dos células delta una alta en comparación con alfa dos delta una células bajas.
La morfología típica de las esferas y la eficiencia de la formación de la esfera se muestra aquí. Alfa dos delta una célula alta muestra mayor eficiencia de formación de la esfera, lo que sugiere una mayor capacidad de auto-renovación. Aquí se muestran imágenes típicas de colonias y curvas de supervivencia.
Una colonia con unas 50 células puede ser examinada bajo un microscopio y marcada como referencia. Se cuenta el número de colonias, luego se puede calcular una fracción de supervivencia en cada dosis y se puede trazar una curva de supervivencia. Alfa dos delta una célula alta son relativamente resistentes a la radiación en comparación con alfa dos delta una célula baja.
Cualquier paso relacionado con el cultivo celular debe realizarse en el gabinete de seguridad biológica o en el banco limpio laminar. Para evitar la contaminación, se recomienda añadir antibióticos al medio de cultivo después de la clasificación. Cuando un marcador de células madre de cáncer putativo se identifica preliminarmente mediante el ensayo de formación de la esfera, se puede realizar una mayor caracterización mediante un ensayo de dilución limitador in vivo para evaluar la capacidad tumorigénica.
A partir del estudio del mecanismo de radiorresitariación, los investigadores pueden examinar la proteína relacionada con la reparación del daño del ADN, el aclaramiento de especies reactivas de oxígeno y la detención del ciclo celular en respuesta a la radiación. Durante la radiación celular, tenga en cuenta que el acelerador lineal solo puede ser operado por técnicos cualificados. Manténgase alejado de la radiación.
Mientras esté de pie, tenga en cuenta que el formaldehído es volátil y peligroso. Use formaldehído en la campana de humos.
