Kanser kök hücrelerinin varlığı radyoterapi sonrası nüks veya kötü bir sonuç ile ilişkili olabilir, çünkü bu protokol önemlidir. Radyodirençli kök hücreleri incelemek radyodirencini aşmak için ipuçları sağlayabilir. Bu teknikte, kanser kök hücreleri akış sitometrisi ile putatif belirteçlerle tuzlanır ve tuzlu hücrelerin kendini yenileme kapasitesi küre oluşumu sonucu değerlendirilir.
Koloni oluşumu töztuzlu hücrelerin radyosensitivite değerlendirmek için yapılır. Belirli bir doz radyasyondan sonra koloniyi oluşturan sentezi üretme yeteneğini kaç hücrenin kaybettiğini belirler. Bu el yazması kanser kök hücrelerinin radyosensitivite çalışması için ilk birkaç adım sağlar, hangi dolgun mekanizma çalışması için temel oluşturur.
Mekanizma çalışması DNA hasarı onarımı, reaktif oksijen türlerinin temizlenmesi, hücre döngüsü nün tutuklanması vb. ile ilgili proteinleri içerebilir. Bu kanser kök hücrelerinin radyodirenç almak ve nasıl direnç üstesinden gelmek için önemli bilgiler sağlayacaktır. Radyasyon prosedürünü gösteren Chen-Nan Li, bölümümüzden bir radyasyon teknisyeni olacak.
Bu prosedüre başlamak için, RPMI-1640 orta kültür A549 hücreleri 37 derece santigrat, % 5 karbondioksit ile 10 santimetre yemeklerde% 10 FBS ile desteklenmiştir. Hücreler %80-90'lık biraraya geldiğinde, kültür ortamını kaldırın. Hücreleri üç mililitre PBS ile kısaca yıkayın.
Sonra, her çanağa % 0.05 tripsin üç mililitre ekleyin. Tripsin çıkarın ve bir ila üç dakika boyunca 37 santigrat derece hücreleri sindirmek için residüary tripsin bırakın. Aşırı sindirimönlemek için sık sık hücrelerin müfrezesini kontrol edin.
Hücreler gevşediğinde ve yemeklerden çıkmaya başladığında, %10 FBS ile desteklenen üç mililitre RPMI-1640 ortamı ekleyin ve hücreleri süspansiyonu 50 mililitrelik bir tüpe aktarın. Santrifüj 300 kez g ve dört santigrat derecede beş dakika. Supernatant atın ve PBS 10 mililitre hücreleri resuspend.
Hücre süspansiyonunun 0,5 mililitresini izotip kontrolü olarak yeni bir tüpe aktarın. Kontrol ve deneysel tüpleri 300 kez g ve dört santigrat derecede beş dakika santrifüj edin. Supernatants atın.
Daha sonra, pbs'deki floresan dikonjuge izotip kontrolünü ve antikorları çalışma çözümcürüniçin titre edilen en uygun konsantrasyona seyreltin. Her çalışma çözeltisi ile kontrol ve deneysel hücreleri yeniden askıya alın ve hafifçe karıştırın. Örnekleri karanlıkta ve oda sıcaklığında 30-40 dakika kuluçkaya yatırın.
Hücreleri 10 mililitre PBS ekleyerek, hafifçe karıştırarak ve 300 kez g ve dört santigrat derecede beş dakika santrifüj ederek yıkayın. Supernatants atın ve PBS 10 mililitre ile hücreleri yeniden askıya. Daha sonra, kontrol ve deneysel hücreler için ayrı bir tüp ve süzgeç kurulum hazırlamak için emin olun, yeni 50 mililitre tüpler üzerinde 40 mikrometre hücre süzgeçleri yerleştirin.
Her hücre süspansiyonu ilgili süzgeç üzerine uygulayın ve akış toplamak. 300 kez g ve dört santigrat derecede beş dakika boyunca akışı santrifüj. Supernatant atın ve PBS 0.2 ila 1.0 mililitre ile hücreleri yeniden askıya ve akış sitometri için ayrı bir beş mililitrelik tüp içine her hücre süspansiyon aktarın.
Biyolojik bir güvenlik kabininde, sıfır gri grubu da dahil olmak üzere her radyasyon dozu için bir altı kuyu plakası hazırlayın. Her kuyuya tamamlanmış 1640 ortama 1,5 mililitre ekleyin. Tamamlanmış 1640 ortamla toplanan hücreleri mililitre başına 1.000 hücrelik bir hücre yoğunluğuna seyreltin.
Sonra, kuyulara seyreltilmiş hücre süspansiyon ekleyin ve kuyularda hücreleri eşit dağıtmak için yatay plakaları sallamak. Her doz grubuna eklenen hacmi kaydedin. Kültür 37 derecede %5 karbondioksitle.
Hücreler kuyuların altına bağlandıktan sonra, ortam yüksekliği bir santimetreye ulaşana kadar her kuyuya tamamlanmış 1640 ortam ekleyin. Plakalar hücre kültür odası ve radyasyon terapi odası arasında transfer edildiğinde, alüminyum folyo ile plakaları sarın veya kontaminasyonu önlemek için temiz bir kutuya koyun. Orta dışarı dökülmesini önlemek için plakaları düz tutun.
Sırada, 20 santimetrelik radyasyon alanı 20 santimetre olarak ayarlanır. Tedavi kanepesine 1.0 santimetre kalınlığında bir doku eşdeğeri bolus yerleştirin ve temas halinde tutmak için bolus üzerinde altı kuyu plaka yerleştirin. Tüm plakanın radyasyon alanı içinde olduğundan emin ol.
Kaynak-cilt mesafesini 100 santimetre olarak ayarlayın ve tedavi kanepesinin yüksekliğini orta yüzey seviyesini lazer seviyesine göre ayarlayın. Atanan dozu her tabağa sırayla teslim edin. Bundan sonra, hücre kültür odasında biyogüvenlik kabine plakaları almak.
Her kuyudaki orta yı tamamlanmış 1640 orta iki mililitre ile değiştirin. Kültür 37 derecede %5 karbondioksitle, her üç ila beş günde bir orta yıkıntmayı sağlıyor. Radyasyondan 7 ila 10 gün sonra, ortamı çıkarın ve hücreleri PBS ile kısaca yıkayın.
Bir duman başlık olarak, 10 dakika boyunca hücreleri düzeltmek için her iyi% 4 formaldehit bir mililitre ekleyin. Sonra, formaldehit çıkarın ve her yıkama için distile su iki mililitre kullanarak her iki kez yıkayın. Her kuyuya %1'lik kristal mor leke çözeltisi ve 10 dakika boyunca bir mililitre lik kristal mor leke çözeltisi ekleyin.
Bundan sonra, Kristal mor leke çözeltisi çıkarın ve distile su ile hücreleri üç kez yıkayın. Suyu çıkarın ve plakaların 30 dakika kurumasına izin verin. 50'den fazla hücreye sahip kolonilerin sayısını sayın.
Bu çalışmada, hem alfa iki delta bir yüksek ve alfa iki delta bir düşük A549 hücreleri sıralanır. Bazı işaretçiler farklı popülasyonlar gösterebilir ve geçit kolaydır. Ancak, bazı belirteçler sadece yüksek ve düşük ifade desenleri göstermek yerine, ayırt edici pozitif ve negatif popülasyonlar.
Bu durumda, bir isotip kontrolü gating için çok önemlidir. Sıralanmış hücrelerde alfa iki delta bir ifadesi qPCR tarafından doğrulanır. CACNA2D1 ifadesi, alfa iki delta bir kodlayan gen, alfa iki delta bir düşük hücreleri ile karşılaştırıldığında sıralanmış alfa iki delta bir yüksek hücreler daha yüksektir.
Kürelerin tipik morfolojisi ve küre oluşum etkinliği burada gösterilmiştir. Alfa iki delta bir yüksek hücreler daha yüksek küre oluşumu verimliliği göstermek, daha yüksek bir kendini yenileme kapasitesi düşündüren. Kolonilerin ve hayatta kalma eğrilerinin tipik görüntüleri burada gösterilmiştir.
Yaklaşık 50 hücreli bir koloni mikroskop altında incelenebilir ve referans olarak işaretlenebilir. Kolonilerin sayısı sayılır, daha sonra her dozda bir sağkalım fraksiyonu hesaplanabilir ve bir sağkalım eğrisi çizilebilir. Alfa iki delta bir yüksek hücreler nispeten radyasyona karşı alfa iki delta bir düşük hücrelere göre dayanıklıdır.
Hücre kültürü ile ilgili her türlü adım biyolojik güvenlik kabininde veya laminar temiz tezgahta yapılmalıdır. Kontaminasyonu önlemek için, sıralama dan sonra kültür ortamına antibiyotik eklenmesi tavsiye edilir. Bir putatif kanser kök hücre belirteci preliminarily küre oluşumu tsay tarafından tespit edildiğinde, in vivo sınırlayıcı seyreltme tetkik ile daha fazla karakterizasyon tümörijenik kapasiteyi değerlendirmek için yapılabilir.
Radyodirenç mekanizması çalışmadan, araştırmacılar DNA hasar onarımı ile ilgili protein inceleyebilirsiniz, reaktif oksijen türlerinin temizlenmesi, ve radyasyona yanıt olarak hücre döngüsü arrest. Hücre radyasyonu sırasında, doğrusal hızlandırıcının sadece kalifiye teknisyenler tarafından çalıştırılabilen bir şey olduğunu lütfen unutmayın. Radyasyondan uzak durun.
Ayakta dururken, formaldehituçucu ve tehlikeli olduğunu unutmayın. Duman kaputunda formaldehit kullanın.
