このプロトコルは、癌幹細胞の存在が再発または放射線治療後の悪い結果と関連する可能性があるため、有意である。放射線耐性幹細胞を研究することは、放射線耐性を克服するための手がかりを提供するかもしれない。この技術では、癌幹細胞は、フローサイトメトリーによって推定マーカーで塩漬けされ、塩漬細胞の自己再生能力は球形成アッセイによって評価される。
コロニー形成アッセイは、塩漬細胞の放射線感受性を評価するために行われる。これは、ある線量の放射線の後にコロニーを形成する合成を生成する能力を失った細胞の数を決定します。本稿は、がん幹細胞の放射線感受性研究の初期の数ステップを提供し、より充実したメカニズム研究の基礎を確立する。
メカニズム研究は、DNA損傷修復、活性酸素種のクリアランス、細胞周期の停止などに関連するタンパク質を含む可能性があります。がん幹細胞が放射性抵抗を得る方法と抵抗を克服する方法に関する重要な洞察を提供します。放射線手順のデモンストレーションは、当部門の放射線技術者である陳南李です。
この手順を開始するには、37°Cで10センチメートルの皿で10%FBSを補充したRPMI-1640培地中のA549細胞を5%の二酸化炭素で培養する。細胞が80〜90%合流に達したら、培養培地を除去する。PBSの3ミリリットルで細胞を簡単に洗います。
次に、各皿に0.05%トリプシンの3ミリリットルを加えます。トリプシンを取り除き、レジダリートリプシンを残して37°Cで細胞を1〜3分間消化します。過剰消化を避けるために頻繁に細胞の剥離をチェックしてください。
細胞が緩んで皿から外れ始めると、RPMI-1640培地の3ミリリットルを10%FBSで補い、細胞懸濁液を50ミリリットルチューブに移します。300倍gで遠心分離機、摂氏4度で5分間。上清を捨て、PBSの10ミリリットルで細胞を再懸濁します。
0.5ミリリットルの細胞懸濁液をアイソタイプコントロールとして新しいチューブに移します。遠心分離管は、コントロールチューブと実験管の両方を300倍g、摂氏4度で5分間行います。上清を捨てます。
次いで、PBS中の蛍光異型アイソタイプコントロールと抗体の両方を最適濃度に希釈し、働く溶液を調製する。各作業溶液でコントロールと実験細胞を再中断し、穏やかに混合します。暗い温度と室温で30〜40分間サンプルをインキュベートします。
PBSを10ミリリットル加え、穏やかに混合し、300倍gと摂氏4度で5分間遠心分離して細胞を洗います。上清を捨て、PBSの10ミリリットルで細胞を再中断します。次に、新しい50ミリリットルチューブに40マイクロメートルの細胞ストレーナーを配置し、コントロールと実験細胞用の別のチューブとストレーナーのセットアップを準備してください。
各細胞懸濁液を各ストレーナーに塗布し、フロースルーを収集します。流れは300倍g、摂氏4度で5分間遠心する。上清を捨て、PBSの0.2〜1.0ミリリットルで細胞を再懸濁し、各細胞懸濁液をフローサイトメトリー用の別の5ミリリットルチューブに移します。
生物学的安全キャビネットでは、ゼログレー群を含む放射線量ごとに1つの6つのウェルプレートを準備します。完成した1640メディアを1.5ミリリットルずつ各井戸に加えます。1640培地を完成させた細胞を1ミリリットル当たり1,000細胞の細胞密度に希釈する。
その後、希釈した細胞懸濁液をウェルに加え、プレートを水平に振ってウェル内の細胞を均等に分配します。各用量群に追加されたボリュームを記録します。5%の二酸化炭素を摂氏37度で培養する。
細胞がウェルの底に取り付けられた後、メディアの高さが1センチメートルに達するまで、完成した1640メディアを各井戸に追加します。プレートが細胞培養室と放射線治療室の間で移動したら、プレートをアルミニウム箔で包むか、汚れを避けるために清潔な箱に入れます。プレートを平らに持って、中程度がこぼれないようにします。
次に、20センチメートルの放射線場で20センチメートルに設定します。治療ソファに厚さ1.0センチメートルの組織等価ボーラスを置き、それらを接触させるためにボーラスの上に6つのウェルプレートを置きます。プレート全体が放射線場内であることを確認します。
ソーススキンの距離を 100 センチメートルに設定し、中面レベルをレーザー レベルに合わせて、処理カウチの高さを調整します。割り当てられた線量を各プレートに順番に送ります。この後、細胞培養室のバイオセーフティキャビネットにプレートを持って行きます。
完成した1640培地の2ミリリットルで各ウェルの媒体を交換してください。摂氏37度で5%の二酸化炭素を培養し、3~5日ごとに培地を交換してください。放射線照射から7~10日後、培地を取り出し、PBSで細胞を短時間洗います。
ヒュームフードで、各ウェルに4%ホルムアルデヒドの1ミリリットルを加えて、10分間細胞を固定します。その後、ホルムアルデヒドを取り出し、洗浄ごとに2ミリリットルの蒸留水を使用して各ウェルを2回洗浄します。1%結晶紫色の汚れ溶液を1ミリリットルずつよく加え、10分間染色します。
この後、結晶紫色の汚れ溶液を取り除き、蒸留水で細胞を3回洗浄します。水を取り出し、プレートを30分間乾燥させます。50個を超えるセルを持つコロニーの数を数えます。
本研究では、アルファ2デルタ1高とアルファ2デルタ1低A549セルの両方がソートされる。一部のマーカーは、異なる集団を示し、ゲートが容易です。ただし、一部のマーカーは、特徴的な正と負の母集団ではなく、高い表現パターンと低い表現パターンを示しています。
この場合、等値制御は、格言にとって非常に重要です。ソートされたセルにおけるアルファ2デルタ1の式は、qPCRによって検証される。また、Α2デルタ1をコードする遺伝子であるCACNA2D1の発現は、アルファ2デルタ1低細胞と比較して、並べ替えされたアルファ2δ1高細胞において高い。
球の代表的な形態と球形成効率をここに示す。アルファ2δ1高細胞は、より高い球形成効率を示し、より高い自己再生能力を示唆する。コロニーと生存曲線の典型的な画像がここに示されています。
約50個の細胞を有するコロニーを顕微鏡で調べ、基準としてマークすることができる。コロニーの数をカウントし、その後、各用量での生存率を計算することができ、生存曲線をプロットすることができます。アルファ2デルタ1高細胞は、アルファ2デルタ1低細胞と比較して放射に対して比較的耐性である。
細胞培養に関連するステップは、生物学的安全キャビネットまたは層状クリーンベンチで行う必要があります。汚染を避けるために、選別後に培地に抗生物質を添加することをお勧めします。推定癌幹細胞マーカーが球形成アッセイによって予備的に同定される場合、さらなる特徴付けは、インビボ制限希釈アッセイにより、腫瘍形成能力を評価するために行うことができる。
放射線抵抗のメカニズム研究から、研究者は、放射線に応答してDNA損傷修復、活性酸素種のクリアランス、および細胞周期の逮捕に関連するタンパク質を調べることができます。細胞の放射線の間、線形加速器は資格のある技術者によってのみ操作することができることに注意してください。放射線から遠ざけてください。
立っている間、ホルムアルデヒドは揮発性で危険であることに注意してください。ヒュームフードにホルムアルデヒドを使用してください。
