Questo protocollo è significativo perché la presenza di cellule staminali tumorali può essere associata a ricaduta o a un esito negativo dopo la radioterapia. Lo studio delle cellule staminali radioresistenti può fornire indizi per superare la radioreistenza. In questa tecnica, le cellule staminali tumorali sono salate con marcatori putativi per citometria del flusso e la capacità di auto-rinnovamento delle cellule salate viene valutata per test di formazione della sfera.
Il saggio di formazione della colonia viene eseguito per valutare la radiosensibilità delle cellule salate. Determina quante cellule hanno perso la loro capacità di generare la sintesi che forma la colonia dopo una certa dose di radiazioni. Questo manoscritto fornisce i primi passi per lo studio della radiosensibilità delle cellule staminali tumorali, che stabilisce le basi per uno studio più completo del meccanismo.
Lo studio del meccanismo può coinvolgere proteine legate alla riparazione dei danni al DNA, alla clearance delle specie reattive dell'ossigeno, all'arresto del ciclo cellulare, ecc. Fornirà importanti informazioni su come le cellule staminali tumorali ottengono la radioreistenza e su come superare la resistenza. A dimostrare la procedura di radiazioni sarà Chen-Nan Li, un tecnico delle radiazioni del nostro dipartimento.
Per iniziare questa procedura, coltura A549 cellule in mezzo RPMI-1640 integrato con 10%FBS in piatti di 10 centimetri a 37 gradi Celsius, con 5% di anidride carbonica. Quando le celle raggiungono l'80-90% di confluenza, rimuovere il supporto di coltura. Lavare brevemente le cellule con tre millilitri di PBS.
Aggiungere quindi tre millilitri dello 0,05% di triptina a ciascun piatto. Rimuovere la tripina e lasciare la tripina residuaria per digerire le cellule a 37 gradi Celsius per uno o tre minuti. Controllare frequentemente il distacco delle cellule per evitare la sovragestione.
Quando le cellule si allentano e iniziano a staccarsi dai piatti, aggiungere tre millilitri di mezzo RPMI-1640 integrati con 10%FBS e trasferire la sospensione delle cellule in un tubo da 50 millilitri. Centrifuga a 300 volte g e a quattro gradi Celsius per cinque minuti. Scartare il supernatante e rimescolare le cellule in 10 millilitri di PBS.
Trasferire 0,5 millilitri della sospensione cellulare in un nuovo tubo come controllo dell'isotipo. Centrifugare sia i tubi di controllo che i tubi sperimentali a 300 volte g e quattro gradi Celsius per cinque minuti. Scartare i supernatanti.
Quindi, diluire sia il controllo dell'isotipo di coniugato fluorescente che l'anticorpo in PBS alla concentrazione ottimale titolazione per preparare la soluzione di lavoro. Resuspendare le celle di controllo e sperimentali con ogni soluzione di lavoro e mescolare delicatamente. Incubare i campioni al buio e a temperatura ambiente per 30-40 minuti.
Lavare le cellule aggiungendo 10 millilitri di PBS, mescolando delicatamente e centrifugando a 300 volte g e a quattro gradi Celsius per cinque minuti. Scartare i supernaganti e rimospendare le cellule con 10 millilitri di PBS. Quindi, posizionare filtri a celle da 40 micrometri su nuovi tubi da 50 millilitri, assicurandosi di preparare una configurazione separata del tubo e del filtro per le celle di controllo e sperimentali.
Applicare ogni sospensione cellulare sul rispettivo colino e raccogliere il flusso attraverso. Centrifugare il flusso a 300 volte g e a quattro gradi Celsius per cinque minuti. Scartare il supernatante e rimescolare le cellule con da 0,2 a 1,0 millilitri di PBS e trasferire ogni sospensione cellulare in un tubo separato da cinque millilitri per la citometria a flusso.
In un armadietto di sicurezza biologico, preparare una piastra di sei pozze per ogni dose di radiazione, incluso il gruppo grigio zero. Aggiungere 1,5 millilitri di supporti 1640 completati ad ogni pozzo. Diluire le cellule raccolte con 1640 supporti completati a una densità cellulare di 1.000 cellule per millilitro.
Quindi, aggiungere la sospensione cellulare diluita ai pozzi e scuotere le piastre orizzontalmente per distribuire uniformemente le cellule nei pozzi. Registrare il volume aggiunto in ciascun gruppo di dosi. Cultura a 37 gradi Celsius con 5% di anidride carbonica.
Dopo che le celle si sono attaccate alla parte inferiore dei pozzi, aggiungere 1640 supporti completati a ciascun pozzo fino a quando l'altezza del supporto raggiunge un centimetro. Quando le piastre vengono trasferite tra la stanza di coltura cellulare e la stanza di radioterapia, avvolgere le piastre con un foglio di alluminio o metterle in una scatola pulita per evitare la contaminazione. Tenere le piastre piatte per evitare fuoriuscite medie.
Successivamente, impostare a 20 centimetri per 20 centimetri campo di radiazione. Posizionare un bolo equivalente tessuto di 1,0 centimetri di spessore sul divano di trattamento e posizionare la piastra a sei pozza sul bolo per tenerli in contatto. Assicurarsi che l'intera piastra si trova all'interno del campo di radiazione.
Impostare la distanza sorgente-pelle su 100 centimetri e regolare l'altezza del divano di trattamento per allineare il livello medio della superficie al livello laser. Consegnare la dose assegnata a ciascuna piastra in sequenza. Dopo questo, porta i piatti all'armadietto della biosicurezza nella stanza della coltura cellulare.
Sostituire il mezzo in ogni pozzo con due millilitri di mezzo 1640 completato. Cultura a 37 gradi Celsius con 5% di anidride carbonica, assicurandosi di cambiare il mezzo ogni tre o cinque giorni. Da sette a 10 giorni dopo la radiazione, rimuovere il mezzo e lavare brevemente le cellule con PBS.
In una cappa aspirante aggiungere un millilitro di formaldeide al 4% ad ogni pozzo per fissare le cellule per 10 minuti. Quindi, rimuovere la formaldeide e lavare ogni bene due volte usando due millilitri di acqua distillata per ogni lavaggio. Aggiungere un millilitro di 1%Soluzione di macchia viola cristallo ad ogni pozzo e macchiare per 10 minuti.
Successivamente, rimuovere la soluzione di macchia viola cristallo e lavare le cellule tre volte con acqua distillata. Rimuovere l'acqua e lasciare asciugare le piastre all'aria per 30 minuti. Conta il numero di colonie con più di 50 cellule.
In questo studio, sia alfa due delta uno alto e alfa due delta una bassa A549 cellule sono ordinati. Alcuni marcatori possono mostrare popolazioni distinte e sono facili da recintare. Tuttavia, alcuni marcatori mostrano solo modelli di espressione alti e bassi, piuttosto che popolazioni positive e negative distintive.
In questa situazione, un controllo dell'isotipo è molto importante per la gating. L'espressione di alfa due delta uno nelle celle ordinate viene convalidata da qPCR. L'espressione di CACNA2D1, il gene che codifica alfa due delta uno, è più alta in alfa ordinato due delta una cellule alte rispetto ad alfa due delta una low cells.
Qui viene mostrata la morfologia tipica delle sfere e l'efficienza della formazione della sfera. Alpha due delta una alta cellule mostrano una maggiore efficienza di formazione della sfera, suggerendo una maggiore capacità di auto-rinnovamento. Qui vengono mostrate immagini tipiche delle colonie e delle curve di sopravvivenza.
Una colonia con circa 50 cellule può essere esaminata al microscopio e contrassegnata come riferimento. Viene conteggiato il numero di colonie, quindi è possibile calcolare una frazione di sopravvivenza ad ogni dose e tracciare una curva di sopravvivenza. Alfa due delta una cellule alte sono relativamente resistenti alle radiazioni rispetto ad alfa due delta una bassa cellule.
Qualsiasi passo relativo alla coltura cellulare deve essere eseguito nell'armadio di sicurezza biologico o nel banco pulito laminare. Per evitare la contaminazione, si consiglia di aggiungere antibiotici al mezzo di coltura dopo lo smistamento. Quando un marcatore di cellule staminali tumorali putative è preventivamente identificato dal saggio di formazione della sfera, è possibile eseguire un'ulteriore caratterizzazione mediante test di diluizione limitante in vivo per valutare la capacità tumorale.
Dallo studio del meccanismo di radioreistenza, i ricercatori possono esaminare la proteina correlata alla riparazione dei danni al DNA, alla clearance delle specie reattive dell'ossigeno e all'arresto del ciclo cellulare in risposta alle radiazioni. Durante la radiazione cellulare, si prega di notare che l'acceleratore lineare può essere azionato solo da tecnici qualificati. Tenere lontano dalle radiazioni.
In piedi, si prega di notare che la formaldeide è volatile e pericolosa. Utilizzare formaldeide nella cappa dei fumi.
