DPPは、細胞の宿主に、細胞内でトランスクリプションに影響を与えるシグナルを送ることによって、細胞の運命に影響を与える。DPPが産生されるが放出されない場合、受容体にアクセスできないため、その役割を果たすことができません。この技術により、研究者はDPP放出ダイナミクスを変化させる遺伝的および環境的要因を調べることができ、DPPリリースを可視化することが可能になる。
BMPシグナル伝達経路はハエからヒトまで保存されているので、DPP放出を指示するメカニズムは人間の発達と再生にも関連すると予想されます。30から40処女女性のDPP GAL4は10〜15雄のUAS DPP-GFPフライで飛ぶから始めます。新鮮なバイアルに少量の酵母ペーストを加えて産卵を促します。
卵を収集するには、交差したハエをバイアルに反転させ、それらを取り除く前に3〜4時間産むことを可能にします。幼虫が3番目の星の段階になるまで、約144時間、卵のコレクションバイアルを摂氏25度に保ちます。次に、解剖のために適切な幼虫を選択します。
まず、短くて脂肪ではなく、通常の長さになる非結核である幼虫を選択します。DPP-GFP発現幼虫を選択するには、蛍光ステレオ顕微鏡で見てください。すべての非結核の幼虫は蛍光を持ちますが、GFPは翼ディスクに制限され、DPP-GFP幼虫の明るさが低くなります。
画像のために翼ディスクを生き続ける原稿の指示に従って変更されたHL3メディアを準備する。HEPESでpHを7.1に調整し、0.22マイクロメートルのフィルタでフィルタリングします。顕微鏡スライドに無色両面テープ幅を2枚置き、その間に約5ミリメートルのスペースを残し、テープの端がスライドの端で洗い流されていることを確認します。
平らな端を使用して、テープをスライドにしっかりと押し込みます。2枚のテープの間に、25マイクロリットルの修正されたHL3メディアを追加します。翼ディスクをメディアに取り付けると、テープの破片がカバースリップで押しつぶされるのを防ぎます。
幼虫を解剖するには、変更されたHL3培地に入れ、2組の鉗子を使用して半分に軽く引き裂きます。後部半分を捨て、1組の鉗子で前半分の中央をつかみ、もう一方のペアを使用して口のフックを完全に反転するまで幼虫に押し戻します。幼虫の両側を走る気管の2つの暗い色の一次枝の鋭い曲がりを探します。
翼ディスクは真下にあります。ディスクを静かに取り外し、準備したスライドのHL3メディアに入れて、ディスクにまだ気管が取り付けられていないことを確認します。翼の袋の心面がディスクが平らに横たわる上向きになるように翼ディスクを配置します。
カバースリップで翼を覆い、マニキュアで密封します。磨きが乾燥したら、すぐにイメージングを進めます。40X油目的と488ナノメートルレーザーを備えた共焦点レーザー走査顕微鏡を使用して、取り付けられた翼ディスクを画像化します。
2つのヘルツの速度で2分間画像を収集します。最良の結果を得るには、レーザーパワーを十分に強くして、DPP放出細胞の鮮明な画像を得て、漂白を避けます。時系列として画像を収集し、DPPリリースのビデオを取得するためにAVIファイルとしてそれらをエクスポートします。
プロトコルが成功すると、DPP-GFPは、非蛍光円として見える核を持つ翼ディスクの中心を下にストライプとして表示されます。DPP-GFP放出は、細胞体の内外に現れ、遠く離れた蛍光穿刺として見える。明確なパンクタは、シトーネミーまたはシトーメシナプスで可能性が高い.
翼ディスクは、心膜側からイメージングが行われるように取り付けられています。翼ディスクが裏面から画像化されると、DPP-GFP蛍光が焦点外に現れ、解像度が悪くなります。GFPがDPPに融合しない場合、細胞体の外側に穿刺は認められない。
このコントロールは、DPP-GFP の動作が GFP と異なっていることを示しています。さらに、DPP-GFPが発現していない場合には蛍光穿刺は現れない。この手順の間、翼ディスクが心膜側に取り付けられていることが重要である。
翼ディスクの向きが不適切な場合、DPP-GFPは焦点が合っていないように見えます。この方法は、翼のないまたはヘッジホッグのような他の発達シグナル伝達リガンドの放出を研究するために使用することができる。私たちは、DPPの放出に影響を与える可能性のあるすべての異なる環境および遺伝的要因を探求することができます。
また、この方法を他の細胞タイプからのBMP放出を研究するために適応させることができる。
