DPP влияет на судьбу клеток, связывая рецепторы и посылая сигнал внутриклеточно влиять на транскрипцию. Если DPP производится, но не выпущен, он не имеет доступа к рецепторам и, следовательно, не может выполнять свои роли. Этот метод позволяет визуализировать выпуск DPP, что позволяет исследователям изучить, какие генетические и экологические факторы меняют динамику выпуска DPP.
Сигнальный путь БМП сохраняется от мух к человеку, поэтому мы ожидаем, что механизм, который диктует выпуск DPP, также будет актуален для развития и регенерации человека. Начните с пересечения от 30 до 40 девственных женщин DPP GAL4 летает с 10 до 15 мужчин UAS DPP-GFP мух. Поощряйте укладку яиц, добавляя небольшое количество дрожжевой пасты в свежий флакон пищи.
Чтобы собрать яйца, переверните скрещенных мух во флакон и дайте им отложить в течение трех-четырех часов, прежде чем удалить их. Держите флаконы сбора яиц на 25 градусов по Цельсию в течение примерно 144 часов, пока личинки находятся на третьей стадии instar. Затем выберите соответствующие личинки для вскрытия.
Во-первых, выбрать личинки, которые не являются ТБ, которые будут нормальной длины, а не короткие и толстые. Чтобы выбрать DPP-GFP, выражаюющий личинки, просмотрите их под стерео микроскопом флуоресценции. Все личинки, не противотуберкулезные, будут иметь некоторую флуоресценцию, но GFP ограничен дисками крыла и менее яркий на личинках DPP-GFP.
Подготовьте модифицированные средства массовой информации HL3 в соответствии с рукописными указаниями, которые будут поддерживать живую визуализацию дисков крыла. Отрегулируйте рН до 7,1 с помощью HEPES, затем отфильтруйте его через фильтр 0,22 микрометра. Поместите два куска бесцветной двусторонний ширины ленты мудрым через слайд микроскоп оставив пространство около пяти миллиметров между ними и убедившись, что концы ленты лежат покраснел с краями слайда.
Используйте плоский край, чтобы прижимать ленту твердо к слайду. Добавьте 25 микролитров модифицированных HL3-медиа между двумя частями ленты. Когда диск крыла установлен в средствах массовой информации, куски ленты будет предотвратить его от дробленая обложка.
Чтобы вскрыть личинку, поместите ее в модифицированные HL3-средства и аккуратно разорвите пополам, используя две пары типсов. Отбросьте заднюю половину, а затем схватить середину передней половины с одной парой типсов и использовать другую пару, чтобы подтолкнуть рот крючки обратно в личинку, пока она полностью инвертирована. Ищите острые изгибы в двух темных цветных первичных ветвях трахеи, которые бегут по обе стороны личинки.
Диски крыла лежат прямо под ним. Аккуратно удалите диски и поместите их в HL3-медиа на подготовленном слайде, убедившись, что к дискам все еще не прикреплены кусочки трахеи. Упорядочить крыла диски так, что периподиальная сторона крыла мешок сталкивается вверх с диском лежал плоский.
Обложка крыло с крышкой и печать с лаком для ногтей. После того, как польский сухой, немедленно приступить к визуализации. Изображение установленного диска крыла с помощью конфокального лазерного сканирующего микроскопа с целью 40X нефти и 488 нанометрового лазера.
Сбор изображений со скоростью двух герц в течение двух минут. Для получения наилучших результатов, установить мощность лазера достаточно сильны, чтобы получить четкое изображение DPP-выпускающих клеток, чтобы избежать более отбеливания. Соберите изображения в серии времени и экспортировать их в качестве файлов AVI для получения видео релиза DPP.
Когда протокол успешен, DPP-GFP появляется как полоса вниз по центру диска крыла с ядрами видимыми как нефлуоресцентные круги. Выпуск DPP-GFP виден как флуоресцентная панкта, которая появляется и исчезает как внутри, так и далеко от тел клеток. Различные панкты, вероятно, в цитономах или в цитономе синапсах.
Диски крыла монтируются таким образом, чтобы изображение было сделано с периподиальной стороны. Если диск крыла изображен с обратной стороны, флуоресценция DPP-GFP будет выглядеть не в фокусе, а разрешение будет плохим. Когда GFP не сливается с DPP, нет puncta за пределами клеток органов не наблюдается.
Этот элемент управления показывает, что DPP-GFP ведет себя иначе, чем GFP в одиночку. Кроме того, нет флуоресцентных puncta появляются, когда DPP-GFP не выражается. Во время этой процедуры важно, чтобы диск крыла был установлен периподиальной стороной вверх.
Если диск крыла неправильно ориентирован, DPP-GFP появится вне фокуса. Этот метод может быть использован для изучения выпуска других развития сигнализации лиганды, как бескрылый или еж. Мы можем исследовать все различные экологические и генетические факторы, которые могут повлиять на выпуск DPP.
Кроме того, мы можем адаптировать этот метод для изучения BMP-релиза от других типов клеток.
