DPP afecta el destino celular mediante la unión de receptores y el envío de una señal intracelularmente para afectar la transcripción. Si DPP se produce pero no se libera, no tiene acceso a los receptores y por lo tanto no puede realizar sus funciones. Esta técnica permite visualizar la liberación de DPP, lo que permite a los investigadores examinar qué factores genéticos y ambientales cambian la dinámica de liberación de DPP.
La vía de señalización BMP se conserva de las moscas a los seres humanos, por lo que esperamos que el mecanismo que dicta la liberación de DPP también sea relevante para el desarrollo humano y la regeneración. Comience cruzando de 30 a 40 moscas vírgenes DPP GAL4 con 10 a 15 moscas macho UAS DPP-GFP. Fomente la puesta de huevos añadiendo una pequeña cantidad de pasta de levadura a un frasco fresco de alimentos.
Para recoger los huevos, voltee las moscas cruzadas en el vial y dé móntelos durante tres o cuatro horas antes de retirarlos. Mantenga los viales de recolección de huevos a 25 grados centígrados durante aproximadamente 144 horas hasta que las larvas estén en la tercera etapa instar. A continuación, seleccione las larvas apropiadas para la disección.
En primer lugar, elija larvas que no sean de TB que sean de longitud normal en lugar de cortas y grasas. Para seleccionar las larvas que expresan DPP-GFP, visualízalas bajo un microscopio estéreo de fluorescencia. Todas las larvas que no sean de tuberculosis tendrán algo de fluorescencia, pero la GFP está restringida a los discos de las alas y es menos brillante en las larvas DPP-GFP.
Prepare medios HL3 modificados de acuerdo con las instrucciones del manuscrito que mantendrán vivos los discos de las alas para la toma de imágenes. Ajuste el pH a 7.1 con HEPES y luego filtre a través de un filtro de 0,22 micrómetros. Coloque dos piezas de ancho de cinta incoloro de doble cara sabiamente a través de una diapositiva del microscopio dejando un espacio de unos cinco milímetros entre ellos y asegurándose de que los extremos de la cinta estén enrojecidos con los bordes de la diapositiva.
Utilice un borde plano para presionar la cinta firmemente a la diapositiva. Agregue 25 microlitros del soporte HL3 modificado entre las dos piezas de cinta. Cuando el disco del ala se monta en el soporte, las piezas de cinta evitarán que sea aplastado por el cubreobjetos.
Para diseccionar la larva, colóquela en el medio HL3 modificado y rasgue suavemente por la mitad usando dos pares de fórceps. Deseche la mitad posterior, luego agarre el centro de la mitad anterior con un par de fórceps y use el otro par para empujar los ganchos de la boca de nuevo en la larva hasta que se invierta completamente. Busque las curvas afiladas en las dos ramas primarias de color más oscuro de la tráquea que corren por ambos lados de la larva.
Los discos de las alas se encuentran directamente debajo. Retire suavemente los discos y colóquelos en el soporte HL3 de la diapositiva preparada asegurándose de que no haya trozos de tráquea todavía conectados a los discos. Coloque los discos de las alas de modo que el lado peripodial de la bolsa del ala esté mirando hacia arriba con el disco acostado.
Cubra el ala con un cubreobjetos y selle con esmalte de uñas. Una vez que el esmalte esté seco, proceda inmediatamente con la toma de imágenes. Imagen del disco de ala montado utilizando un microscopio de escaneo láser confocal con un objetivo de aceite 40X y un láser de 488 nanómetros.
Recoge imágenes a una velocidad de dos hercios durante dos minutos. Para obtener mejores resultados, establezca la potencia del láser lo suficientemente fuerte como para obtener una imagen clara de las células liberadoras de DPP para evitar el exceso de blanqueo. Recoge las imágenes como una serie temporal y expórtelas como archivos AVI para obtener un vídeo de la versión DPP.
Cuando el protocolo es exitoso, DPP-GFP aparece como una franja por el centro del disco del ala con núcleos visibles como círculos no fluorescentes. La liberación de DPP-GFP es visible como puncta fluorescente que aparecen y desaparecen tanto dentro como lejos de los cuerpos celulares. Los puncta distintos son probables en citonios o en sinapsis de citonios.
Los discos de las alas se montan de modo que la imagen se realiza desde el lado peripodial. Si el disco del ala se visualiza desde el reverso, la fluorescencia DPP-GFP aparecerá fuera de foco y la resolución será deficiente. Cuando la GFP no se fusiona con DPP, no se observa ninguna puncta fuera de los cuerpos celulares.
Este control demuestra que DPP-GFP se comporta de manera diferente que GFP solo. Además, no aparece ninguna puncta fluorescente cuando no se expresa DPP-GFP. Durante este procedimiento, es importante que el disco del ala esté montado en el lado peripodial hacia arriba.
Si el disco del ala está mal orientado, DPP-GFP aparecerá desenfocado. Este método podría utilizarse para estudiar la liberación de otros ligandos de señalización del desarrollo como sin alas o erizo. Podemos explorar todos los diferentes factores ambientales y genéticos que pueden afectar la liberación de DPP.
Además, podemos adaptar este método para estudiar la liberación BMP de otros tipos de células.
