O DPP afeta o destino celular ligando receptores e enviando um sinal intracelularmente para afetar a transcrição. Se o DPP for produzido, mas não for liberado, ele não tem acesso a receptores e, portanto, não pode desempenhar suas funções. Essa técnica possibilita visualizar a liberação de DPP permitindo que os pesquisadores examinem quais fatores genéticos e ambientais alteram a dinâmica de liberação de DPP.
A via de sinalização BMP é conservada de moscas para humanos, por isso esperamos que o mecanismo que dita a liberação de DPP também seja relevante para o desenvolvimento humano e a regeneração. Comece cruzando de 30 a 40 moscas virgens DPP GAL4 com moscas de 10 a 15 moscas UAS DPP-GFP masculinas. Incentive a colocação de ovos adicionando uma pequena quantidade de pasta de levedura a um frasco fresco de alimentos.
Para coletar os ovos, vire as moscas cruzadas para o frasco e deixe-as colocar por três a quatro horas antes de removê-los. Mantenha os frascos de coleta de ovos a 25 graus Celsius por aproximadamente 144 horas até que as larvas estejam no terceiro estágio instar. Em seguida, selecione as larvas apropriadas para dissecção.
Primeiro, escolha larvas que não sejam TB que serão de comprimento normal em vez de curto e gordo. Para selecionar as larvas expressas DPP-GFP, visualize-as sob um microscópio estéreo de fluorescência. Todas as larvas não-TB terão alguma fluorescência, mas o GFP é restrito aos discos de asa e é menos brilhante nas larvas DPP-GFP.
Prepare a mídia HL3 modificada de acordo com as instruções do manuscrito que manterão os discos de asa vivos para imagens. Ajuste o pH para 7.1 com HEPES e depois filtre-o através de um filtro de 0,22 micrômetros. Coloque duas peças de largura de fita dupla face incolor em um slide de microscópio deixando um espaço de cerca de cinco milímetros entre eles e certificando-se de que as extremidades da fita estão lavadas com as bordas do slide.
Use uma borda plana para pressionar a fita firmemente para o slide. Adicione 25 microliters da mídia HL3 modificada entre as duas peças de fita. Quando o disco de asa é montado na mídia, as peças de fita evitarão que ele seja esmagado pelo deslizamento de tampa.
Para dissecar a larva, coloque-a na mídia HL3 modificada e rasgue-a suavemente ao meio usando dois pares de fórceps. Descarte a metade posterior, depois segure o meio da metade anterior com um par de fórceps e use o outro par para empurrar os ganchos da boca de volta para a larva até que ela seja completamente invertida. Procure as curvas afiadas nos dois ramos primários de cor mais escura da traqueia que escorrem pelos dois lados da larva.
Os discos das asas estão diretamente embaixo. Remova suavemente os discos e coloque-os na mídia HL3 no slide preparado certificando-se de que nenhuma peça de traqueia ainda esteja presa aos discos. Organize os discos de asa para que o lado peripodial da bolsa de asa esteja voltado para cima com o disco deitado.
Cubra a asa com uma mancha de cobertura e selado com esmalte. Uma vez que o polimento esteja seco, proceda imediatamente com imagens. Imagem do disco de asa montado usando um microscópio de varredura a laser confocal com um objetivo de óleo 40X e um laser de 488 nanômetros.
Colete imagens a uma velocidade de dois hertz por dois minutos. Para obter melhores resultados, defina a potência laser forte o suficiente para obter uma imagem clara das células liberadoras de DPP para evitar o branqueamento excessivo. Colete as imagens como uma série temporal e exporte-as como arquivos AVI para obter um vídeo da versão DPP.
Quando o protocolo é bem sucedido, o DPP-GFP aparece como uma faixa no centro do disco de asa com núcleos visíveis como círculos não fluorescentes. A liberação de DPP-GFP é visível como puncta fluorescente que aparecem e desaparecem dentro e longe dos corpos celulares. As punctas distintas são provavelmente em citonemes ou em sinápsias de citonemes.
Os discos de asa são montados para que a imagem seja feita do lado peripodial. Se o disco de asa for imageado do lado inverso, a fluorescência DPP-GFP aparecerá fora de foco e a resolução será ruim. Quando o GFP não é fundido ao DPP, não são observadas puncta fora dos corpos celulares.
Este controle demonstra que o DPP-GFP se comporta de forma diferente apenas do GFP. Além disso, nenhuma puncta fluorescente aparece quando o DPP-GFP não é expresso. Durante este procedimento, é importante que o disco de asa seja montado lado peripodial para cima.
Se o disco de asa estiver inadequadamente orientado, o DPP-GFP aparecerá fora de foco. Este método poderia ser usado para estudar a liberação de outros ligantes de sinalização de desenvolvimento, como sem asas ou ouriços. Podemos explorar todos os diferentes fatores ambientais e genéticos que podem afetar a liberação de DPP.
Além disso, podemos adaptar este método para estudar a liberação de BMP de outros tipos de células.
