Le DPP affecte le destin cellulaire en liant les récepteurs et en envoyant un signal intracellulaire pour affecter la transcription. Si DPP est produit mais non libéré, il n’a pas accès aux récepteurs et ne peut donc pas remplir ses rôles. Cette technique permet de visualiser les rejets de DPP permettant aux chercheurs d’examiner quels facteurs génétiques et environnementaux modifient la dynamique des rejets du DPP.
La voie de signalisation BMP est conservée des mouches à l’homme, donc nous nous attendons à ce que le mécanisme qui dicte la libération du DPP soit également pertinent pour le développement humain et la régénération. Commencez par traverser 30 à 40 mouches femelles vierges DPP GAL4 avec 10 à 15 uas mâles DPP-GFP mouches. Encourager la ponte en ajoutant une petite quantité de pâte de levure à un flacon frais d’aliments.
Pour recueillir les œufs, retournez les mouches croisées dans le flacon et laissez-les pondre pendant trois à quatre heures avant de les enlever. Gardez les flacons de collecte d’œufs à 25 degrés Celsius pendant environ 144 heures jusqu’à ce que les larves en soient au troisième stade du stade. Sélectionnez ensuite les larves appropriées pour la dissection.
Tout d’abord, choisissez les larves qui ne sont pas tb qui sera la longueur normale plutôt que court et la graisse. Pour sélectionner le DPP-GFP exprimant les larves, visualisez-les au microscope stéréo fluorescence. Toutes les larves non tuberculeuses auront une certaine fluorescence, mais le GFP est limité aux disques d’aile et est moins brillant sur les larves du DPP-GFP.
Préparez des supports HL3 modifiés selon les instructions manuscrites qui garderont les disques d’aile en vie pour l’imagerie. Réglez le pH à 7,1 avec HEPES puis filtrez-le à travers un filtre de 0,22 micromètre. Placez deux morceaux de largeur de ruban à double face incolore sage à travers une diapositive de microscope laissant un espace d’environ cinq millimètres entre eux et en s’assurant que les extrémités de la bande se trouvent rincées avec les bords de la diapositive.
Utilisez un bord plat pour appuyer fermement sur la bande jusqu’à la glissière. Ajouter 25 microlitres des supports HL3 modifiés entre les deux morceaux de ruban adhésif. Lorsque le disque d’aile est monté dans les supports, les morceaux de ruban l’empêchent d’être écrasé par le coverslip.
Pour disséquer la larve, placez-la dans les supports HL3 modifiés et déchirez-la doucement en deux à l’aide de deux paires de forceps. Jeter la moitié postérieure, puis saisir le milieu de la moitié antérieure avec une paire de forceps et utiliser l’autre paire pour pousser les crochets de la bouche de nouveau dans la larve jusqu’à ce qu’il soit complètement inversé. Recherchez les virages serrés dans les deux branches primaires de couleur plus foncée de la trachée qui descendent des deux côtés de la larve.
Les disques d’aile se trouvent directement en dessous. Retirez délicatement les disques et placez-les dans les supports HL3 sur la diapositive préparée en vous assurant qu’aucun morceaux de trachée n’est encore fixé aux disques. Disposer les disques d’aile de sorte que le côté péripodial de la poche de l’aile soit orienté vers le haut avec le disque couché à plat.
Couvrir l’aile d’un coverslip et sceller avec du vernis à ongles. Une fois que le vernis est sec, procédez immédiatement à l’imagerie. Image du disque d’aile monté à l’aide d’un microscope à balayage laser confocal avec un objectif d’huile 40X et un laser de 488 nanomètres.
Recueillir des images à une vitesse de deux hertz pendant deux minutes. Pour de meilleurs résultats, réglez la puissance laser juste assez fort pour obtenir une image claire des cellules de libération DPP pour éviter le blanchiment. Collecter les images comme une série de temps et de les exporter sous forme de fichiers AVI pour obtenir une vidéo de la version DPP.
Lorsque le protocole est couronné de succès, DPP-GFP apparaît comme une bande au centre du disque d’aile avec des noyaux visibles sous forme de cercles non fluorescents. La libération de DPP-GFP est visible sous forme de ponction fluorescente qui apparaissent et disparaissent à la fois dans et loin des corps cellulaires. Les ponctions distinctes sont probablement dans les cytonémes ou aux synapses de cytonémes.
Les disques d’aile sont montés de sorte que l’imagerie se fait du côté péripodial. Si le disque d’aile est photographié du côté inverse, la fluorescence DPP-GFP apparaîtra hors de discussion et la résolution sera faible. Lorsque GFP n’est pas fusionné au DPP, aucune ponction à l’extérieur des corps cellulaires n’est observée.
Ce contrôle démontre que le DPP-GFP se comporte différemment de gfp seul. En outre, aucune ponction fluorescente n’apparaît lorsque le DPP-GFP n’est pas exprimé. Au cours de cette procédure, il est important que le disque d’aile soit monté côté péripodial vers le haut.
Si le disque d’aile est mal orienté, DPP-GFP apparaîtra hors de discussion. Cette méthode pourrait être utilisée pour étudier la libération d’autres ligands de signalisation développementale comme sans ailes ou hérisson. Nous pouvons explorer tous les différents facteurs environnementaux et génétiques qui peuvent affecter la libération de DPP.
En outre, nous pouvons adapter cette méthode pour étudier la libération de BMP à partir d’autres types de cellules.
