DPP reseptörleri bağlayarak hücre kaderini etkiler ve transkripsiyon etkilemek için hücre içi bir sinyal gönderme. DPP üretilir ancak serbest bırakılmazsa, reseptörlere erişimi yoktur ve bu nedenle rollerini yerine getiremez. Bu teknik, araştırmacıların hangi genetik ve çevresel faktörlerin DPP salınım dinamiklerini değiştirdiğini incelemelerini sağlayan DPP salınımLarını görselleştirmeyi mümkün kılar.
BMP sinyal yolu sineklerden insanlara kadar korunur, bu yüzden DPP salınımını belirleyen mekanizmanın da insan gelişimi ve yenilenmesi için uygun olmasını bekliyoruz. 30-40 bakire dişi DPP GAL4 10 ila 15 erkek UAS DPP-GFP sinekler ile uçar geçerek başlayın. Taze bir gıda şişesine az miktarda maya salçası ekleyerek yumurtlamayı teşvik edin.
Yumurtaları toplamak için, çapraz sinekleri şişeye çevirin ve çıkarmadan önce 3-4 saat yumurtlamalarına izin verin. Larvalar üçüncü yıldız aşamasında olana kadar yumurta toplama şişelerini yaklaşık 144 saat boyunca 25 derecede tutun. Sonra diseksiyon için uygun larvaseçin.
İlk olarak, kısa ve yağ yerine normal uzunlukta olacak tüberküloz olmayan larvaları seçin. Larvaları ifade eden DPP-GFP'yi seçmek için, bunları floresan stereo mikroskop altında görüntüleyin. Tüberküloz olmayan tüm larvalar bazı floresan lara sahip olur, ancak GFP kanat diskleri ile sınırlıdır ve DPP-GFP larvaları üzerinde daha az parlaktır.
Kanat disklerini görüntüleme için canlı tutacak el yazması talimatlara göre modifiye HL3 ortamhazırlayın. HEPES ile pH'ı 7,1'e ayarlayın ve 0,22 mikrometrelik bir filtreden geçirin. İki adet renksiz çift taraflı bant genişliğini mikroskop slaytına yerleştirin ve aralarında yaklaşık beş milimetrelik bir boşluk bırakarak ve bandın uçlarının kaydıraktan kenarlarıyla kızardığından emin olun.
Bandı slayta sıkıca bastırmak için düz bir kenar kullanın. İki bant parçası arasına modifiye edilmiş HL3 ortamının 25 mikrolitresini ekleyin. Kanat diski ortama monte edildiğinde, bant parçaları kapak kayması tarafından ezilmekten önler.
Larvayı incelemek için, modifiye edilmiş HL3 ortamına yerleştirin ve iki çift forceps kullanarak yavaşça ikiye bölün. Arka yarısı atın, sonra bir çift forceps ile ön yarısında orta kavramak ve tamamen ters kadar larva içine ağız kanca geri itmek için diğer çifti kullanın. Larvanın her iki tarafından aşağı doğru çalışan trakeanın iki koyu renkli ana dalındaki keskin kıvrımlara bakın.
Kanat diskleri doğrudan altında yatıyor. Diskleri yavaşça çıkarın ve hazırlanan slayttaki HL3 ortamına koyarak disklere hala trakea parçalarının bağlı olmadığından emin olun. Kanat disklerini, kanat kesesinin peripodial tarafının diskdüz yatarken yukarı bakacak şekilde düzenleyin.
Bir coverslip ve oje ile mühür ile kanat kapağı. Cila kurudıktan sonra, hemen görüntüleme ile devam edin. 40X yağ hedefi ve 488 nanometre lazer ile konfokal lazer tarama mikroskobu kullanarak monte kanat diski görüntüleyin.
İki dakika boyunca iki hertz hızında görüntüleri toplayın. En iyi sonuçlar için, lazer gücünü, ağartma üzerinde önlemek için DPP serbest hücrelerin net bir görüntü elde etmek için yeterince güçlü ayarlayın. Bir zaman serisi olarak görüntüleri toplamak ve DPP sürümü bir video elde etmek için AVI dosyaları olarak dışa aktarın.
Protokol başarılı olduğunda, DPP-GFP kanat diskinin merkezinde bir şerit olarak görünür ve çekirdekleri floresan olmayan daireler olarak görünür. DPP-GFP salınımı, hücre gövdelerinde ve hücre gövdelerinden uzakta görünen ve kaybolan floresan puncta olarak görülebilir. Farklı puncta sitoknemes veya sitokinmes sinaps muhtemeldir.
Kanat diskleri, görüntülemeperipodial tarafından yapılacak şekilde monte edilir. Kanat diski ters taraftan görüntülenirse, DPP-GFP floresansı odak dışında görünür ve çözünürlük zayıf olur. GFP DPP'ye eritilemediğinde, hücre vücutlarının dışında hiçbir delinme gözlenmez.
Bu denetim, DPP-GFP'nin tek başına GFP'den farklı davrandığını gösterir. Ayrıca, DPP-GFP ifade edilmezse floresan puncta görünür. Bu işlem sırasında kanat diskinin peripodial tarafa monte edilmiş olması önemlidir.
Kanat diski yanlış yönlendirilmişse, DPP-GFP odak dışında görünür. Bu yöntem kanatsız veya kirpi gibi diğer gelişimsel sinyal ligands salınımını incelemek için kullanılabilir. DPP salınımını etkileyebilecek tüm farklı çevresel ve genetik faktörleri inceleyebiliriz.
Buna ek olarak, diğer hücre tiplerinden BMP salınımı çalışma için bu yöntemi uyarlayabilirsiniz.
