DPP beeinflussen das Zellschicksal, indem sie Rezeptoren bindet und ein Signal intrazellulär sendet, um die Transkription zu beeinflussen. Wenn DPP produziert, aber nicht veröffentlicht wird, hat es keinen Zugriff auf Rezeptoren und kann daher seine Rollen nicht ausführen. Diese Technik ermöglicht es, die DPP-Freisetzung zu visualisieren und ermöglicht es den Forschern zu untersuchen, welche genetischen und ökologischen Faktoren die DPP-Freisetzungsdynamik verändern.
Der BMP-Signalweg wird von Fliegen zum Menschen konserviert, so dass wir erwarten, dass der Mechanismus, der die DPP-Freisetzung vorschreibt, auch für die menschliche Entwicklung und Regeneration relevant sein wird. Beginnen Sie mit der Überquerung von 30 bis 40 jungfräulichen weiblichen DPP GAL4-Fliegen mit 10 bis 15 männlichen UAS-DPP-GFP-Fliegen. Fördern Sie die Eiablage, indem Sie eine kleine Menge Hefepaste zu einer frischen Durchstechflasche mit Lebensmitteln hinzufügen.
Um die Eier zu sammeln, kippen Sie die gekreuzten Fliegen in die Durchstechflasche und lassen Sie sie für drei bis vier Stunden liegen, bevor Sie sie entfernen. Halten Sie die Eiersammelfläschchen bei 25 Grad Celsius für ca. 144 Stunden, bis die Larven im dritten Instar-Stadium sind. Wählen Sie dann die entsprechenden Larven für die Zerlegung aus.
Wählen Sie zunächst Larven, die nicht TB sind, die normale Länge statt kurz und fett sein wird. Um das DPP-GFP zu wählen, das Larven exzessiiert, sehen Sie sie unter einem Fluoreszenz-Stereomikroskop. Alle Nicht-TB-Larven haben eine gewisse Fluoreszenz, aber das GFP ist auf die Flügelscheiben beschränkt und ist weniger hell auf den DPP-GFP-Larven.
Bereiten Sie modifizierte HL3-Medien nach Manuskriptanweisungen vor, die die Flügelscheiben für die Bildgebung am Leben erhalten. Stellen Sie den pH-Wert mit HEPES auf 7,1 ein und filtern Sie ihn dann durch einen 0,22-Mikrometer-Filter. Legen Sie zwei Stücke farbloser doppelseitiger Bandbreite weise über ein Mikroskopschlitten und lassen Sie einen Abstand von etwa fünf Millimetern zwischen sich und stellen Sie sicher, dass die Enden des Bandes mit den Rändern des Dias gespült liegen.
Verwenden Sie eine flache Kante, um das Band fest auf die Folie zu drücken. Fügen Sie 25 Mikroliter des modifizierten HL3-Mediums zwischen die beiden Bandstücke. Wenn die Flügelscheibe in den Medien montiert ist, verhindern die Bandstücke, dass sie durch den Deckelbeschlag zerquetscht wird.
Um die Larve zu sezieren, legen Sie sie in das modifizierte HL3-Medium und zerreißen Sie sie vorsichtig mit zwei Zangenpaaren. Entsorgen Sie die hintere Hälfte, dann greifen Sie die Mitte der vorderen Hälfte mit einem Paar Zange und verwenden Sie das andere Paar, um die Mundhaken zurück in die Larve zu drücken, bis sie vollständig invertiert ist. Achten Sie auf die scharfen Biegungen in den beiden dunkleren primären Zweigen der Luftröhre, die beide Seiten der Larve verlaufen.
Die Flügelscheiben liegen direkt darunter. Entfernen Sie die Scheiben vorsichtig und legen Sie sie in das HL3-Medium auf dem vorbereiteten Dia, um sicherzustellen, dass noch keine Luftröhre an den Scheiben befestigt ist. Ordnen Sie die Flügelscheiben so an, dass die Peripodial-Seite des Flügelbeutels nach oben zeigt und die Scheibe flach liegt.
Bedecken Sie den Flügel mit einem Deckelund Dichtung mit Nagellack. Sobald die Politur trocken ist, gehen Sie sofort mit der Bildgebung fort. Stellen Sie die montierte Flügelscheibe mit einem konfokalen Laserscanmikroskop mit einem 40-fachen Ölobjektiv und einem 488-Nanometer-Laser auf.
Sammeln Sie Bilder mit einer Geschwindigkeit von zwei Hertz für zwei Minuten. Um optimale Ergebnisse zu erzielen, stellen Sie die Laserleistung gerade stark genug, um ein klares Bild der DPP-releasing Zellen zu erhalten, um über Bleichen zu vermeiden. Sammeln Sie die Bilder als Zeitreihe und exportieren Sie sie als AVI-Dateien, um ein Video der DPP-Version zu erhalten.
Wenn das Protokoll erfolgreich ist, erscheint DPP-GFP als Streifen in der Mitte der Flügelscheibe mit Kernen, die als nicht fluoreszierende Kreise sichtbar sind. Die DPP-GFP-Freisetzung ist als fluoreszierende Punkta sichtbar, die sowohl in als auch weit weg von den Zellkörpern erscheinen und verschwinden. Die deutlichen Puncta sind wahrscheinlich in Zytonen oder bei Cytoneme-Synapsen.
Die Flügelscheiben sind so montiert, dass die Bildgebung von der Peripodial-Seite aus erfolgt. Wenn die Flügelscheibe von der Rückseite abgebildet wird, erscheint die DPP-GFP-Fluoreszenz aus dem Fokus und die Auflösung wird schlecht sein. Wenn GFP nicht mit DPP verschmolzen ist, werden keine Punktzeichen außerhalb der Zellkörper beobachtet.
Diese Kontrolle zeigt, dass sich DPP-GFP anders verhält als GFP allein. Darüber hinaus erscheinen keine fluoreszierenden Puncta, wenn DPP-GFP nicht ausgedrückt wird. Während dieses Verfahrens ist es wichtig, dass die Flügelscheibe peripodial Seite nach oben montiert wird.
Wenn die Flügelscheibe falsch ausgerichtet ist, erscheint DPP-GFP aus dem Fokus. Diese Methode könnte verwendet werden, um die Freisetzung von anderen entwicklungssignalen Liganden wie flügellos oder Igel zu studieren. Wir können alle verschiedenen ökologischen und genetischen Faktoren untersuchen, die die Freisetzung von DPP beeinflussen können.
Darüber hinaus können wir diese Methode anpassen, um die BMP-Freisetzung von anderen Zelltypen zu untersuchen.
