DPP는 수용체를 결합하고 전사에 영향을 미치는 신호를 세포내로 전송하여 세포 운명에 영향을 미칩니다. DPP가 생산되지만 출시되지 않으면 수용체에 액세스 할 수 없으므로 역할을 수행 할 수 없습니다. 이 기술을 통해 DPP 릴리스를 시각화하여 연구원들이 DPP 방출 역학을 변화시키는 유전적 및 환경 적 요인을 조사할 수 있습니다.
BMP 신호 경로는 파리에서 인간에게 보존되므로 DPP 방출을 지시하는 메커니즘도 인간 개발 및 재생과 관련이 있을 것으로 기대합니다. 시작 30~40 처녀 여성 DPP GAL4 비행 10 받는 번째 수컷 UAS DPP-GFP 파리. 신선한 음식 유리병에 소량의 효모 페이스트를 추가하여 계란 누워를 장려하십시오.
계란을 수집하려면 교차 된 파리를 유리병으로 뒤집어 서 3 ~ 4 시간 동안 누워서 제거하십시오. 애벌레가 세 번째 인스타 스테이지에 오를 때까지 달걀 수집 바이알을 섭씨 25도에서 약 144시간 동안 보관하십시오. 그런 다음 해부에 적합한 애벌레를 선택합니다.
첫째, 짧고 지방이 아닌 정상적인 길이가 될 비 결핵인 애벌레를 선택하십시오. 유충을 발현하는 DPP-GFP를 선택하려면 형광 스테레오 현미경으로 볼 수 있습니다. 모든 비 결핵 유충은 약간의 형광을 가질 것이지만, GFP는 날개 디스크로 제한되고 DPP-GFP 애벌레에서 덜 밝습니다.
이미징을 위해 날개 디스크를 살아 있게 하는 원고 지시에 따라 수정된 HL3 미디어를 준비합니다. HEPES로 pH를 7.1로 조정한 다음 0.22 마이크로미터 필터를 통해 필터링합니다. 현미경 슬라이드에 무색 양면 테이프 너비 두 조각을 현명하게 배치하여 그 사이에 약 5 밀리미터의 공간을 남기고 테이프끝이 슬라이드 가장자리로 플러시되어 있는지 확인합니다.
평평한 가장자리를 사용하여 테이프를 슬라이드에 단단히 누릅니다. 두 개의 테이프 사이에 수정된 HL3 용지의 마이크로리터 25개를 추가합니다. 날개 디스크가 미디어에 장착되면 테이프 조각이 커버슬립에 의해 분쇄되는 것을 방지합니다.
애벌레를 해부하려면 수정된 HL3 미디어에 놓고 두 쌍의 포셉을 사용하여 반으로 부드럽게 찢습니다. 후방 반쪽을 버리고, 한 쌍의 포셉으로 전방 반의 중간을 잡고 다른 쌍을 사용하여 입 후크를 완전히 반전 될 때까지 유충으로 다시 밀어 넣습니다. 애벌레의 양쪽을 따라 내려가는 기관지의 어두운 색의 두 가지에서 날카로운 굴곡을 찾아본다.
날개 디스크바로 아래에 놓여 있습니다. 디스크를 부드럽게 제거하고 준비된 슬라이드의 HL3 미디어에 넣어 기관조각이 디스크에 부착되어 있지 않도록 합니다. 날개 디스크를 정렬하여 날개 파우치의 위포폴 면이 디스크가 평평하게 누워 있는 가운데 위쪽으로 향하도록 합니다.
커버슬립으로 날개를 덮고 매니큐어로 밀봉합니다. 폴란드어가 건조되면 즉시 이미징을 진행하십시오. 40X 오일 목표와 488 나노미터 레이저가 있는 공초점 레이저 스캐닝 현미경을 사용하여 장착된 날개 디스크를 이미지화합니다.
2 분 동안 두 hertz의 속도로 이미지를 수집합니다. 최상의 결과를 얻으려면, 표백을 피하기 위해 DPP 방출 세포의 명확한 이미지를 얻을 수있을만큼 충분히 강한 레이저 전력을 설정합니다. 이미지를 타임 시리즈로 수집하고 AVI 파일로 내보내 DPP 릴리스 의 비디오를 가져옵니다.
프로토콜이 성공하면 DPP-GFP는 비형광 원으로 보이는 핵을 가진 날개 디스크의 중심 아래로 줄무늬로 나타납니다. DPP-GFP 방출은 세포 체에서 멀리 나타나고 사라지는 형광 말장난으로 보입니다. 뚜렷한 말장난은 시톤메스나 시톤메스 시냅스에서 발생할 수 있습니다.
날개 디스크는 이미징이 peripodial 측에서 수행되도록 장착됩니다. 날개 디스크가 역면에서 이미지화되면 DPP-GFP 형광이 초점이 아닌 것처럼 나타나고 해상도가 좋지 않을 것입니다. GFP가 DPP에 융합되지 않을 때, 세포 체 외부의 말장난은 관찰되지 않는다.
이 컨트롤은 DPP-GFP가 GFP만과 다르게 행동한다는 것을 보여줍니다. 더욱이, DPP-GFP가 표현되지 않을 때 형광 말장난이 나타나지 않습니다. 이 절차 동안 날개 디스크가 위포포다이얼 측을 위로 장착하는 것이 중요합니다.
날개 디스크가 부적절하게 지향되는 경우 DPP-GFP는 초점이 맞춰보입니다. 이 방법은 날개없는 또는 고슴도치와 같은 다른 발달 신호 리간드의 방출을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 우리는 DPP 릴리스에 영향을 미칠 수있는 모든 다른 환경 및 유전 적 요인을 탐구 할 수 있습니다.
또한, 우리는 다른 세포 유형에서 BMP 방출을 연구하기 위해이 방법을 조정할 수 있습니다.
