革兰阴性细菌败血症的新生儿成像模型

我们的协议允许在实验性新生儿败血症模型中实时进行细菌传播和负担跟踪，并能够将其他疾病标志物与病原体负担关联。该协议使我们能够纵向分析个别新生儿小鼠的败血症，提供机会观察和比较感染动态和细菌传播实时。可以使用这种方法对新生儿败血症干预进行临床前测试，从而监测宿主控制细菌的效果。

首先将年龄匹配的幼崽放入生物安全二级柜内的高剂量或低剂量垃圾组。在产后第三或第四天，记录所有幼崽在接种前的重量。将含有 PBS 或高剂量或低剂量大肠杆菌的胰岛素注射器加载到生物安全柜中，将加载的注射器放在冰上。

将新生儿注射到生物安全柜内的干净表面上，将颈部尿布处的皮肤提高，就像擦伤幼崽一样。将针头斜面插入皮肤下方，在皮肤和肌肉之间创建的空间内。当针头可以在皮肤下感觉到时，注射50微升的注射剂，同时释放皮肤的捏合部分，以防止回流，然后缓慢和小心地取出针头。

当所有的幼崽都以同样的方式被注射时，把幼崽还到它们的水坝里。注射后，在适当的实验时间点，立即将笼内与大肠杆菌的新生儿小鼠和大坝放入生物安全二级层流罩，并在微型CT计算机中打开软件。初始化系统并等待舞台温度锁定在 37 摄氏度，CCD 温度锁定在负 90 摄氏度后，将多达四个麻醉幼崽放在成像室的成像盒上，位于易发位置。

关闭成像室门并选择发光成像选项。选择打开滤波器，然后设置激发滤波器以阻塞，设置发射滤波器打开。选择 500、520、560、580、600 和 620 纳米。

然后成像幼崽，然后用大坝将它们返回到笼子，并监测直到麻醉恢复。在适当的实验终点，在生物安全柜中，用70%乙醇给安乐死新生儿洗去，以防止污染，将动物放在右侧。使用钳子抓住腹部和左后腿之间的皮肤，并使用细尖手术剪刀做皮肤切口。

然后继续向动物的背部切开，直到整个脾脏暴露。使用钳子和剪刀从腹部取出脾脏，并将其放在适合其下游应用的溶液中。为了获得肺，完全剥回胸部的皮肤，用垂直的剪刀进入胸骨底部，向上切割，直到肋骨笼裂开。

使用钳子分别抓住左右肺，从胸腔中去除肺部。用剪刀将心脏从肺组织中取出。然后将肺放在适合其下游应用的溶液中。

要进行体外细菌杀菌测定，将未受感染的脾脏放入含有5毫升PBS的无菌培养皿中，放入40微米尼龙过滤器中，并辅以10%胎儿牛血清，并使用无菌的三毫升注射器柱塞将组织分解成单细胞悬浮液。将细胞转移到15毫升离心管中，通过离心收集。每三到四个孢子将颗粒重新在一毫升红细胞解液缓冲液中。

在室温下五分钟后，在PBS中清洗孢子，并在250微升PBS中重新暂停颗粒，并辅以牛血清白蛋白和两毫摩尔EDTA进行计数。接下来，根据制造商的协议，用适当的免疫磁珠分离Ly6 B2阳性细胞，并在黑色或白色96井板中，每100微升完整介质每100微升的5个细胞中播种富集的Ly6 B2阳性细胞。以每井100微升的最终体积，以所需的感染多重性准备细菌 inulum，并单独向每井添加100微升细菌营养或培养基，在细胞培养箱中孵化一小时。

在孵化结束时，用200微升新鲜完整培养基，每毫升根霉素补充100微克，以去除任何剩余的细胞外细菌，将细胞返回到细胞培养箱，再增加两个小时。在孵化结束时和之后的每个实验时间点，使用板读卡器测量盖培养板每个井的发光度，然后将板返回到细胞培养箱，直到下一次阅读。虽然大多数动物在感染后24小时内血液中表现出高浓度的细菌，但一些幼崽血液中的细菌含量较低或检测不到，这表明此时将清除感染。

此外，新生儿Ly6 B2阳性的血细胞感染生物发光大肠杆菌一小时，在去除细胞外细菌和随后的根霉素治疗之前，在三小时内表示发光水平高，随着时间的推移，表明细菌清除。发光细菌的活生生动物成像进一步证实，在感染后10小时和24小时内，新生儿幼崽的细菌传播和生长增加。结合微CT进行病毒内成像有助于识别大脑、肺部和其他周围组织内的感染源。

一些高度感染的小鼠的肺部表现出与炎症整合一致的不透明区域，这些区域与发光细菌信号共同定化。这些假定的炎症外化区域在未受感染的控制肺中未观察到。与对控有关的炎症细胞因子表达也显著增加，在低血组和高内分泌组也观察到显著增加，与肺黄壁明显增厚、肺溢出血增加以及这些动物中的炎症渗透有关。

要记住的最重要的事情是执行正确的技术，当执行注射和严格注意新生儿时，管理麻醉。利用这项技术，我们可以实时可视化新生儿败血症，以研究旨在改善免疫反应的干预措施和宿主定向疗法。