在这个过程中，我们展示了如何在几分钟内从小分子粉末变成三维结构。这是化学界的一项变革性技术。许多化合物不容易长成大晶体。
使用MicroED，我们可以从纳米尺寸的晶体中确定原子分辨率结构。演示该程序的将是加州大学洛杉矶分校教授Mike Martynowycz博士。首先，将少量粉末，液体或固体转移到一个小瓶或管中。
对于已经呈粉末形式的样品，使用盖子密封试管，直到需要样品为止。同样，将液体样品干燥成粉末。将塑料薄膜缠绕在玻璃盖玻片的一端。
将TEM网格放在盖玻片顶部的薄膜上，棕色碳面朝上。然后，将带有网格的载玻片放入辉光放电室，并使用 15 皮安的负设置对盖玻片进行辉光放电约 30 秒。在将样品添加到网格之前，将网格存储在盖玻片上的盖玻片内衬有滤纸的玻璃培养皿内。
使用镊子从覆盖的培养皿中取出辉光放电TEM网格，并将其放在圆形滤纸上，碳面朝上。使用小刮刀取出一小勺粉末，然后将其放在滤纸上TEM网格旁边的小方形玻璃盖玻片上。将另一个小的方形载玻片或盖玻片放在粉末上。
用手指将两个载玻片轻轻摩擦在一起，制成细粉。将盖玻片倾斜并将它们放置在滤纸上的TEM网格上方，然后继续将盖玻片摩擦在一起，仅比发光放电TEM网格高出几厘米。观察粉末是否朝网格下落。
通过取下两个玻璃盖玻片中的一个来盖住细磨的粉末。然后用一张滤纸轻轻地将盖玻片上的细粉刷到TEM网格上。使用一组镊子抓住TEM网格的边缘，确保尖端不会刺穿任何网格方块。
将网格抬到滤纸上方一到两厘米处，并将网格与下面的纸张成 90 度角。轻轻敲击镊子，同时保持网格牢固地镊子以去除任何松散的粉末。用手将带有网格的镊子尖端直接移动到液氮容器中来冷冻网格，然后等待网格和镊子停止沸腾。
在液氮下，将网格放置在样品架中，碳侧朝向，使样品在碳支撑膜之前被光束击中。将样品架装入TEM中，确保网格始终保持在液氮温度。对于自动装载机系统，将夹紧的网格放入液氮冷却容器中的盒中，这允许自动装载机机器人接受盒式磁带，同时保持样品安全，以便在自动装载机和色谱柱之间穿梭。
打开TEM柱阀，使用手面板将放大倍率调节到尽可能低的放大倍率。通过调整手面板上的强度旋钮来找到光束，以便在荧光屏上可以看到圆形明亮区域。在收集高分辨率MicroED数据之前，使用适当的软件在低放大倍率下获取全网格图谱，确保显微镜在低倍和高放大倍率成像中都对准良好。
识别网格方块，薄膜上没有破碎的碳和可见的黑色或深色颗粒。使用手持面板上的操纵杆或在收集的图集上虚拟地在网格周围导航，以搜索未损坏且包含微晶体的网格方块。将这些方块的中心添加到网格位置列表中以进行研究，该位置可以添加到显微镜用户界面或显微镜自动化软件中的笔记本中。
将放大倍率设置为 500 到 1300 倍。调整每个存储的格网位置的中心高度，并将保存的 z 值更新为记下的位置。在荧光屏或平板相机上搜索网格上的小黑点或颗粒。
一个好的样品在高放大倍率下通常会有锋利的边缘，表明晶体是有序的。将定位的电位晶体移动到屏幕中心并增加放大倍率，使TEM进入高放大倍率模式。插入所选区域孔径并将孔径更改为更大或更小的尺寸，以确保所选区域大于晶体。
通过按下TEM手板上的折射按钮切换到折射模式，确保荧光屏已插入。使用放大旋钮调整相机长度，使边缘至少为一个埃分辨率。调整衍射焦点，使中心光斑尽可能清晰和小。
使用衍射移位旋钮，将中心光束移动到荧光屏的中心。插入光束挡块，确保光束在其后面。提起荧光屏并在相机上短暂曝光。
检查相应的折射图案，确保图案具有按列和行规则排列的尖锐斑点。将晶体坐标保存在TEM用户界面中或将其写下来，然后对当前网格方块上所有感兴趣的潜在晶体重复衍射筛选。将筛分的晶体以大于 1000 倍的放大倍数居中，并使用自动程序或手动调整晶体的中心高度。
插入最适合晶体尺寸和形状的选定区域孔径。沿负方向和正方向倾斜舞台，直到图像被网格条遮挡。并记下这些角度以进行数据收集，方法是在具有卷帘快门读出模式的现代相机上每秒读取数据。
通过在显微镜用户界面或专用软件中指定最大倾斜速度的百分比和停止时间来设置旋转速率。将数据保存为各种格式，例如单个帧或作为图像堆栈。从微晶体收集的晶体学格式的折射视频显示了来自TEM网格上鉴定的卡马西平微晶体的连续旋转MicroED数据集。
在数据收集、整合和结构求解后，确定高分辨率结构，其清晰度取决于数据的质量和完整性。将样本应用于网格对于获取良好数据至关重要。按照这种方法，可以使用标准晶体学软件进一步处理数据。
证明MicroED是一种强大的小分子方法，已经在全球范围内用于解决至关重要分子的新结构。
