В этой процедуре мы покажем, как за считанные минуты перейти от мелкомолекулярного порошка к трехмерной структуре. Это преобразующий метод для химического сообщества. Многие соединения нелегко превращаются в крупные кристаллы.
С помощью MicroED мы можем определять структуры с атомным разрешением из кристаллов нанометрового размера. Продемонстрирует процедуру доктор Майк Мартынович, профессор Калифорнийского университета в Лос-Анджелесе. Для начала перелейте небольшое количество порошка, жидкости или твердых веществ в небольшой флакон или тюбик.
Для образцов, уже находящихся в виде порошка, запечатайте пробирку с помощью колпачка до тех пор, пока образец не понадобится. Точно так же высушите жидкие образцы в порошки. Оберните полиэтиленовую пленку вокруг одного конца предметного стекла.
Поместите сетки ПЭМ на пленку поверх покровного стекла карбоновой стороной коричневого цвета вверх. Затем поместите предметное стекло с решетками в камеру тлеющего разряда и нагнетайте свечение защитного стекла в течение примерно 30 секунд, используя отрицательную настройку на 15 пикоампер. Храните решетки на покровном предметном стекле внутри стеклянной чашки Петри, выстланной фильтровальной бумагой, прежде чем добавлять образец в сетки.
Снимите решетку ПЭМ тлеющего разряда с закрытой чашки Петри с помощью пинцета и поместите ее на круглую фильтровальную бумагу карбоновой стороной вверх. С помощью небольшого шпателя удалите очень маленькую ложку порошка и поместите ее на небольшую квадратную стеклянную крышку рядом с сеткой ТЕМ на фильтровальной бумаге. Поместите еще одно небольшое квадратное предметное стекло или защитное стекло поверх порошка.
Пальцами аккуратно потрите два предметных стекла друг о друга, чтобы получился мелкий порошок. Наклоните накладки крышки и расположите их чуть выше сетки ПЭМ на фильтровальной бумаге и продолжайте тереть шликеры друг о друга всего в нескольких сантиметрах над разряженной сеткой ПЭМ. Наблюдайте, падает ли порошок на сетку.
Раскройте мелко измельченный порошок, сняв одно из двух шликеров стеклянной крышки. Затем аккуратно смахните мелкий порошок с крышки, нанесите на сетку ПЭМ с помощью кусочка фильтровальной бумаги. Возьмитесь за край сетки ПЭМ с помощью набора пинцетов, убедившись, что кончики не проколют ни один из квадратов сетки.
Поднимите сетку на один-два сантиметра над фильтровальной бумагой и наклоните сетку под углом 90 градусов к бумаге внизу. Аккуратно постучите по пинцету, удерживая сетку плотно прижатым, чтобы удалить рассыпчатый порошок. Заморозьте решетку, переместив кончик пинцета с сеткой прямо в емкость с жидким азотом вручную, и подождите, пока сетка и пинцет не перестанут кипеть.
Под жидким азотом поместите решетку в держатель образца так, чтобы углеродная сторона была ориентирована таким образом, чтобы образец был поражен лучом перед углеродной опорной пленкой. Загрузите держатель образца в ПЭМ, убедившись, что решетка всегда поддерживается при температуре жидкого азота. Для систем автоматического загрузчика поместите обрезанные решетки в кассету в контейнере с жидким азотом, что позволяет робототехнике автопогрузчика принимать кассету, сохраняя при этом образцы безопасными для перемещения между автозагрузчиком и колонной.
Откройте клапаны колонны ТЭМ и отрегулируйте увеличение с помощью ручных панелей на минимально возможное увеличение. Найдите луч, отрегулировав ручку интенсивности на ручных панелях так, чтобы на флуоресцентном экране была видна круглая яркая область. Возьмите атлас всей сетки с малым увеличением с помощью соответствующего программного обеспечения, убедившись, что микроскоп хорошо выровнен как для малого, так и для большого увеличения, прежде чем собирать данные MicroED с высоким разрешением.
Определите квадраты сетки без разрушенного углерода и видимых черных или темных зерен на пленке. Перемещайтесь по сетке либо физически с помощью джойстика на ручных панелях, либо виртуально по собранному атласу для поиска квадратов сетки, которые не разбиты и содержат микрокристаллы. Добавьте центр каждого из этих квадратов в список мест расположения сетки для исследования, который можно добавить в записную книжку в пользовательском интерфейсе микроскопа или в программном обеспечении автоматизации микроскопа.
Установите увеличение от 500 до 1300x. Отрегулируйте центрическую высоту в каждом месте сохраненной сетки и обновите сохраненное z-значение до отмеченных позиций. Ищите на флуоресцентном экране или на плоской камере небольшие черные пятна или зерна на сетке.
Хороший образец часто будет иметь острые края при большом увеличении, предполагая, что кристалл в порядке. Переместите расположенный потенциальный кристалл в центр экрана и увеличьте увеличение таким образом, чтобы ПЭМ перешел в режим большого увеличения. Вставьте выбранную область апертуры и измените диафрагму на больший или меньший размер, чтобы убедиться, что выбранная область больше, чем кристалл.
Переключитесь в режим дефракции, нажав кнопку дефракции на ручных панелях ПЭМ, убедившись, что люминесцентный экран вставлен. Отрегулируйте длину камеры с помощью ручки увеличения таким образом, чтобы разрешение края было не менее одного ангстрема. Отрегулируйте дифракционный фокус таким образом, чтобы центральное пятно было как можно более резким и маленьким.
С помощью ручек дифракционного сдвига переместите центральный луч в центр флуоресцентного экрана. Вставьте упор балки, убедившись, что балка находится позади нее. Поднимите флуоресцентный экран и сделайте короткую выдержку на камере.
Осмотрите соответствующий паттерн дефракции, убедившись, что в узоре будут острые пятна, которые регулярно располагаются в столбцах и строках. Сохраните координаты кристаллов либо в пользовательском интерфейсе ПЭМ, либо записав их, а затем повторите дифракционный скрининг для всех интересующих потенциальных кристаллов на текущем квадрате сетки. Отцентрируйте экранированный кристалл с увеличением более 1000x и отрегулируйте центрическую высоту кристалла с помощью автоматической процедуры или вручную.
Вставьте выбранную область апертуры, которая наилучшим образом соответствует размеру и форме кристалла. Наклоняйте сцену в отрицательном и положительном направлениях до тех пор, пока изображение не будет закрыто полосами сетки. И обратите внимание на эти углы для целей сбора данных, считывая данные каждую секунду на современной камере с режимом считывания со скользящим затвором.
Установите скорость вращения, указав процент от максимальной скорости наклона и время остановки в пользовательском интерфейсе микроскопа или в специальном программном обеспечении. Сохранять данные в различных форматах можно либо в отдельных кадрах, либо в виде стопки изображений. Фильм о преломлении в кристаллографическом формате, собранный из микрокристаллов, показывает набор данных MicroED непрерывного вращения из микрокристалла карбамазепина, идентифицированного на сетке ПЭМ.
После сбора, интеграции и структурного решения данных определяется структура с высоким разрешением, от качества и полноты которых зависит ее четкость. Применение выборки к сетке имеет решающее значение для получения достоверных данных. Следуя этому методу, данные могут быть дополнительно обработаны с использованием стандартного кристаллографического программного обеспечения.
Демонстрация того, что MicroED является мощным методом для малых молекул, открыла его использование во всем мире для решения новых структур критически важных молекул.
