In diesem Verfahren zeigen wir, wie man in wenigen Minuten von einem niedermolekularen Pulver zu einer dreidimensionalen Struktur gelangt. Dies ist eine transformative Technik für die Chemie-Community. Viele Verbindungen wachsen nicht so leicht zu großen Kristallen heran.
Mit MicroED können wir Strukturen mit atomarer Auflösung aus Kristallen im Nanometerbereich bestimmen. Das Verfahren wird von Dr. Mike Martynowycz, Professor an der UCLA, demonstriert. Geben Sie zunächst eine kleine Menge Pulver, Flüssigkeit oder Feststoffe in eine kleine Durchstechflasche oder ein Röhrchen.
Bei Proben, die bereits in Pulverform vorliegen, verschließen Sie das Röhrchen mit der Kappe, bis die Probe benötigt wird. Trocknen Sie die flüssigen Proben in ähnlicher Weise zu Pulvern. Wickeln Sie Plastikfolie um ein Ende einer Glasabdeckung.
Legen Sie die TEM-Gitter mit der braunen Carbonseite nach oben auf die Folie auf dem Deckdia. Legen Sie dann den Objektträger mit Gittern in die Glimmentladungskammer und entladen Sie den Abdeckdia ca. 30 Sekunden lang mit der Negativeinstellung bei 15 Pikoampere. Bewahren Sie die Gitter auf dem Deckobjektträger in einer mit Filterpapier ausgelegten Glas-Petrischale auf, bevor Sie die Probe in die Gitter geben.
Entfernen Sie das Glimmentladungs-TEM-Gitter mit einer Pinzette von der abgedeckten Petrischale und legen Sie es mit der Kohleseite nach oben auf ein kreisförmiges Filterpapier. Entfernen Sie mit einem kleinen Spatel einen sehr kleinen Löffel Pulver und legen Sie ihn auf ein kleines quadratisches Glasdeckglas direkt neben dem TEM-Gitter auf dem Filterpapier. Legen Sie einen weiteren kleinen quadratischen Glasträger oder Deckglas auf das Pulver.
Reiben Sie die beiden Glasobjektträger mit den Fingern vorsichtig aneinander, um ein feines Pulver herzustellen. Winkeln Sie die Deckgläser an und positionieren Sie sie knapp über dem TEM-Gitter auf dem Filterpapier und reiben Sie die Deckgläser nur wenige Zentimeter über dem glimmentladenen TEM-Gitter weiter aneinander. Beobachte, ob das Pulver in Richtung des Gitters fällt.
Decken Sie das fein gemahlene Pulver auf, indem Sie eines der beiden Glasdeckgläser entfernen. Anschließend das feine Pulver mit einem Stück Filterpapier vorsichtig vom Deckglas auf das TEM-Gitter streichen. Fassen Sie den Rand des TEM-Gitters mit einer Pinzette und achten Sie darauf, dass die Spitzen keines der Gitterquadrate durchstechen.
Heben Sie das Gitter ein bis zwei Zentimeter über das Filterpapier an und winkeln Sie das Gitter in einem Winkel von 90 Grad zum darunter liegenden Papier ab. Klopfen Sie vorsichtig auf die Pinzette, während Sie das Gitter fest zupfen, um loses Puder zu entfernen. Frieren Sie das Gitter ein, indem Sie die Spitze der Pinzette mit dem Gitter von Hand direkt in einen Behälter mit flüssigem Stickstoff schieben, und warten Sie, bis das Gitter und die Pinzette aufhören zu kochen.
Legen Sie das Gitter unter flüssigem Stickstoff so in den Probenhalter, dass die Kohlenstoffseite so ausgerichtet ist, dass die Probe vor der Kohlenstoffträgerfolie vom Strahl getroffen wird. Legen Sie den Probenhalter in das TEM und stellen Sie sicher, dass das Gitter immer auf Flüssigstickstofftemperatur gehalten wird. Legen Sie bei automatischen Ladesystemen die abgeschnittenen Gitter in eine Kassette in einem mit flüssigem Stickstoff gekühlten Behälter, der es der automatischen Laderoboter ermöglicht, die Kassette aufzunehmen und gleichzeitig die Proben sicher für den Transport zwischen dem automatischen Belader und der Säule zu halten.
Öffnen Sie die TEM-Säulenventile und stellen Sie die Vergrößerung mit den Handpulten auf die geringstmögliche Vergrößerung ein. Finden Sie den Strahl, indem Sie den Intensitätsregler an den Handpulten so einstellen, dass ein runder heller Bereich auf dem fluoreszierenden Bildschirm sichtbar ist. Erstellen Sie einen All-Grid-Atlas bei niedriger Vergrößerung mit geeigneter Software, um sicherzustellen, dass das Mikroskop sowohl für die Bildgebung mit niedriger als auch mit hoher Vergrößerung gut ausgerichtet ist, bevor hochauflösende MicroED-Daten erfasst werden.
Identifizieren Sie Rasterquadrate ohne gebrochenen Kohlenstoff und sichtbare schwarze oder dunkle Körner auf der Folie. Navigieren Sie entweder physisch mit dem Joystick auf den Handfeldern oder virtuell auf dem gesammelten Atlas durch das Gitter, um nach Gitterquadraten zu suchen, die nicht zerbrochen sind und Mikrokristalle enthalten. Fügen Sie den Mittelpunkt jedes dieser Quadrate zu einer Liste von Rasterpositionen für die Untersuchung hinzu, die einem Notizbuch in der Mikroskop-Benutzeroberfläche oder in der Mikroskop-Automatisierungssoftware hinzugefügt werden kann.
Stellen Sie die Vergrößerung zwischen 500 und 1300x ein. Passen Sie die zentrische Höhe an jeder gespeicherten Rasterposition an, und aktualisieren Sie den gespeicherten Z-Wert auf die notierten Positionen. Suchen Sie entweder auf dem fluoreszierenden Bildschirm oder auf einer flachen Kamera nach kleinen schwarzen Flecken oder Körnern auf dem Raster.
Eine gute Probe hat bei hoher Vergrößerung oft scharfe Kanten, die darauf hindeuten, dass der Kristall in Ordnung ist. Bewegen Sie einen lokalisierten Potentialkristall in die Mitte des Bildschirms und erhöhen Sie die Vergrößerung so, dass das TEM in den Modus mit hoher Vergrößerung wechselt. Fügen Sie eine Blende für den ausgewählten Bereich ein und ändern Sie die Blende in eine größere oder kleinere Größe, um sicherzustellen, dass der ausgewählte Bereich größer als der Kristall ist.
Wechseln Sie in den Defraktionsmodus, indem Sie die Defraktionstaste an den TEM-Handpulten drücken, um sicherzustellen, dass der fluoreszierende Bildschirm eingesetzt ist. Stellen Sie die Kameralänge mit dem Vergrößerungsknopf so ein, dass der Rand mindestens eine Angström-Auflösung hat. Stellen Sie den Beugungsfokus so ein, dass der zentrale Punkt so scharf und klein wie möglich ist.
Bewegen Sie den zentralen Strahl mit den Beugungsverschiebungsknöpfen in die Mitte des Fluoreszenzschirms. Setzen Sie den Balkenanschlag ein und stellen Sie sicher, dass sich der Balken dahinter befindet. Heben Sie den fluoreszierenden Bildschirm an und machen Sie eine kurze Belichtung mit der Kamera.
Überprüfen Sie das entsprechende Defraktionsmuster und stellen Sie sicher, dass das Muster scharfe Stellen aufweist, die regelmäßig in Spalten und Zeilen angeordnet sind. Speichern Sie die Kristallkoordinaten entweder in der TEM-Benutzeroberfläche oder indem Sie sie aufschreiben, und wiederholen Sie dann das Beugungsscreening für alle potentiellen Kristalle, die auf dem aktuellen Gitterquadrat von Interesse sind. Zentrieren Sie den geschirmten Kristall mit einer Vergrößerung von mehr als 1000x und stellen Sie die zentrische Höhe des Kristalls entweder mit einer automatischen Routine oder von Hand ein.
Fügen Sie die ausgewählte Bereichsöffnung ein, die am besten zur Kristallgröße und -form passt. Kippen Sie den Tisch in die negative und positive Richtung, bis das Bild von den Rasterbalken verdeckt wird. Und notieren Sie diese Winkel für die Datenerfassung, indem Sie die Daten jede Sekunde auf einer modernen Kamera mit Rolling-Shutter-Auslesemodus auslesen.
Stellen Sie die Rotationsrate ein, indem Sie den Prozentsatz der maximalen Neigungsgeschwindigkeit und den Zeitpunkt des Anhaltens in der Benutzeroberfläche des Mikroskops oder in einer speziellen Software angeben. Speichern Sie die Daten in einer Vielzahl von Formaten, z. B. entweder als einzelne Frames oder als Stapel von Bildern. Ein Defraktionsfilm im kristallographischen Format, der von Mikrokristallen aufgenommen wurde, zeigt einen MicroED-Datensatz mit kontinuierlicher Rotation aus einem Carbamazepin-Mikrokristall, der auf einem TEM-Gitter identifiziert wurde.
Nach der Datenerfassung, -integration und -strukturierung wird eine hochauflösende Struktur festgelegt, deren Klarheit von der Qualität und Vollständigkeit der Daten abhängt. Das Anwenden der Stichprobe auf das Raster ist entscheidend für die Erfassung guter Daten. Auf diese Weise können die Daten mit einer kristallographischen Standardsoftware weiterverarbeitet werden.
Der Nachweis, dass MicroED eine leistungsfähige Methode für kleine Moleküle ist, hat ihren weltweiten Einsatz für die Lösung neuer Strukturen kritisch wichtiger Moleküle eröffnet.
