في هذا الإجراء ، نوضح كيفية الانتقال من مسحوق جزيء صغير إلى بنية ثلاثية الأبعاد في دقائق. هذه تقنية تحويلية لمجتمع الكيمياء. العديد من المركبات لا تنمو بسهولة إلى بلورات كبيرة.
باستخدام MicroED ، يمكننا تحديد هياكل الدقة الذرية من بلورات بحجم النانومتر. سيوضح الإجراء الدكتور مايك مارتينوفيتش وهو أستاذ في جامعة كاليفورنيا في لوس أنجلوس. للبدء ، انقل كمية صغيرة من المسحوق أو السائل أو المواد الصلبة إلى قنينة أو أنبوب صغير.
بالنسبة للعينات الموجودة بالفعل في شكل مسحوق ، أغلق الأنبوب باستخدام الغطاء حتى تكون هناك حاجة إلى العينة. وبالمثل ، جفف العينات السائلة إلى مساحيق. لف الفيلم البلاستيكي حول أحد طرفي شريحة الغطاء الزجاجي.
ضع شبكات TEM على الفيلم أعلى شريحة الغطاء مع توجيه جانب الكربون باللون البني لأعلى. بعد ذلك ، ضع الشريحة مع شبكات في غرفة تفريغ التوهج وقم بتفريغ شريحة الغطاء المتوهجة لمدة 30 ثانية تقريبا باستخدام الإعداد السلبي عند 15 بيكوأمبير. قم بتخزين الشبكات على شريحة الغطاء داخل طبق بتري زجاجي مبطن بورق ترشيح قبل إضافة العينة إلى الشبكات.
قم بإزالة شبكة TEM ذات التفريغ المتوهج من طبق بتري المغطى باستخدام ملاقط وضعها على ورق ترشيح دائري بحيث يكون جانب الكربون متجها لأعلى. باستخدام ملعقة صغيرة ، قم بإزالة مغرفة صغيرة جدا من المسحوق وضعها على غطاء زجاجي مربع صغير بجوار شبكة TEM على ورق الترشيح. ضع شريحة زجاجية مربعة صغيرة أخرى أو غطاء فوق المسحوق.
بالأصابع ، افرك الشريحتين الزجاجيتين معا برفق لعمل مسحوق ناعم. قم بزاوية انزلاق الغطاء وضعه فوق شبكة TEM مباشرة على ورق الترشيح واستمر في فرك انزلاقات الغطاء معا على بعد بضعة سنتيمترات فقط فوق شبكة TEM التي تم تفريغها من التوهج. لاحظ ما إذا كان المسحوق يسقط باتجاه الشبكة.
اكشف المسحوق المطحون ناعما عن طريق إزالة إحدى زلات الغطاء الزجاجي. ثم قم بتنظيف المسحوق الناعم برفق من الغطاء على شبكة TEM باستخدام قطعة من ورق الترشيح. أمسك بحافة شبكة TEM باستخدام مجموعة محددة من الملقط ، مع التأكد من أن الأطراف لا تثقب أيا من مربعات الشبكة.
ارفع الشبكة من سنتيمتر إلى سنتيمترين فوق ورق الترشيح وقم بزاوية الشبكة بزاوية 90 درجة إلى الورق أدناه. اضغط برفق على الملقط مع الحفاظ على الشبكة منتفخة بإحكام لإزالة أي مسحوق سائب. قم بتجميد الشبكة عن طريق تحريك طرف الملقط مع الشبكة مباشرة في حاوية النيتروجين السائل باليد وانتظر حتى تتوقف الشبكة والملاقط عن الغليان.
تحت النيتروجين السائل ، ضع الشبكة في حامل العينة مع توجيه جانب الكربون بحيث تصطدم العينة بالشعاع قبل فيلم دعم الكربون. قم بتحميل حامل العينة في TEM للتأكد من أن الشبكة يتم الاحتفاظ بها دائما في درجات حرارة النيتروجين السائل. بالنسبة لأنظمة اللودر التلقائي ، ضع الشبكات المقطوعة في كاسيت في حاوية مبردة بالنيتروجين السائل ، مما يسمح لروبوتات اللودر التلقائي بقبول الكاسيت مع الحفاظ على العينات آمنة للتنقل بين اللودر التلقائي والعمود.
افتح صمامات العمود TEM واضبط التكبير باستخدام لوحات اليد إلى أدنى تكبير ممكن. ابحث عن الشعاع عن طريق ضبط مقبض الشدة على الألواح اليدوية بحيث تكون المنطقة الساطعة المستديرة مرئية على شاشة الفلورسنت. خذ أطلس الشبكة بالكامل بتكبير منخفض باستخدام برنامج مناسب يضمن محاذاة المجهر جيدا لكل من تصوير التكبير المنخفض والعالي قبل جمع بيانات MicroED عالية الدقة.
حدد مربعات الشبكة بدون الكربون المكسور والحبيبات السوداء أو الداكنة المرئية على الفيلم. تنقل حول الشبكة إما فعليا باستخدام عصا التحكم الموجودة على الألواح اليدوية أو فعليا على الأطلس الذي تم جمعه للبحث عن مربعات الشبكة غير المكسورة والتي تحتوي على بلورات دقيقة. أضف مركز كل من هذه المربعات إلى قائمة مواقع الشبكة للتحقيق ، والتي يمكن إضافتها إلى دفتر ملاحظات في واجهة مستخدم المجهر أو في برنامج أتمتة المجهر.
اضبط التكبير بين 500 إلى 1300x. اضبط الارتفاع المركزي في كل موقع شبكة مخزن وقم بتحديث قيمة z المحفوظة إلى المواضع المذكورة. ابحث إما على شاشة الفلورسنت أو على كاميرا مسطحة عن البقع السوداء الصغيرة أو الحبوب على الشبكة.
غالبا ما يكون للعينة الجيدة حواف حادة عند التكبير العالي مما يشير إلى وجود بلورة بالترتيب. انقل بلورة محتملة موجودة إلى وسط الشاشة وقم بزيادة التكبير بحيث يدخل TEM في وضع التكبير العالي. أدخل فتحة منطقة محددة وقم بتغيير فتحة العدسة إلى حجم أكبر أو أصغر للتأكد من أن المساحة المحددة أكبر من البلورة.
قم بالتبديل إلى وضع الانكسار عن طريق الضغط على زر الانكسار على لوحات يد TEM للتأكد من إدخال شاشة الفلورسنت. اضبط طول الكاميرا باستخدام مقبض التكبير بحيث تكون الحافة بدقة أنجستروم واحدة على الأقل. اضبط تركيز الحيود بحيث تكون البقعة المركزية حادة وصغيرة قدر الإمكان.
باستخدام مقابض إزاحة الحيود ، انقل الشعاع المركزي إلى مركز شاشة الفلورسنت. أدخل توقف الشعاع للتأكد من أن الشعاع خلفه. ارفع شاشة الفلورسنت والتقط تعريضا ضوئيا قصيرا للكاميرا.
افحص نمط الانكسار المقابل ، وتأكد من أن النموذج سيحتوي على بقع حادة يتم ترتيبها بانتظام في أعمدة وصفوف. احفظ الإحداثيات البلورية إما في واجهة مستخدم TEM أو عن طريق كتابتها ، ثم كرر فحص الحيود لجميع البلورات المحتملة ذات الأهمية في مربع الشبكة الحالي. قم بتوسيط البلورة التي تم فحصها بتكبير أكبر من 1000x واضبط الارتفاع المركزي للبلورة باستخدام روتين تلقائي أو يدويا.
أدخل فتحة المنطقة المحددة التي تناسب حجم الكريستال وشكله على أفضل وجه. قم بإمالة المرحلة في الاتجاهين السلبي والموجب حتى يتم حجب الصورة بواسطة أشرطة الشبكة. ولاحظ هذه الزوايا لأغراض جمع البيانات من خلال قراءة البيانات كل ثانية واحدة على كاميرا حديثة مع وضع قراءة الغالق المتداول.
اضبط معدل الدوران عن طريق تحديد النسبة المئوية لسرعة الإمالة القصوى ومتى تتوقف في واجهة مستخدم المجهر أو البرنامج المخصص. حفظ البيانات في مجموعة متنوعة من التنسيقات يقول إما إطارات فردية أو ككومة من الصور. يظهر فيلم الانكسار في شكل بلوري تم جمعه من بلورات دقيقة مجموعة بيانات MicroED ذات دوران مستمر من بلورة صغيرة كاربامازيبين محددة على شبكة TEM.
بعد جمع البيانات والتكامل وحل الهيكل ، يتم تحديد بنية عالية الدقة ويعتمد وضوحها على جودة البيانات واكتمالها. يعد تطبيق العينة على الشبكة أمرا بالغ الأهمية للحصول على بيانات جيدة. باتباع هذه الطريقة ، يمكن معالجة البيانات بشكل أكبر باستخدام برنامج البلورات القياسي.
إن إثبات أن MicroED هي طريقة قوية للجزيئات الصغيرة قد فتح استخدامها في جميع أنحاء العالم لحل هياكل جديدة من الجزيئات ذات الأهمية الحاسمة.
