Bu prosedürde, küçük moleküllü bir tozdan üç boyutlu bir yapıya dakikalar içinde nasıl geçileceğini gösteriyoruz. Bu, kimya topluluğu için dönüştürücü bir tekniktir. Birçok bileşik kolayca büyük kristallere dönüşmez.
MicroED ile nanometre boyutundaki kristallerden atomik çözünürlük yapılarını belirleyebiliyoruz. Prosedürü gösteren, UCLA'da profesör olan Dr. Mike Martynowycz olacak. Başlamak için, az miktarda toz, sıvı veya katı maddeyi küçük bir şişeye veya tüpe aktarın.
Zaten toz halinde olan numuneler için, numuneye ihtiyaç duyulana kadar kapağı kullanarak tüpü kapatın. Benzer şekilde, sıvı numuneleri tozlar halinde kurutun. Plastik filmi cam kapak sürgüsünün bir ucunun etrafına sarın.
TEM ızgaralarını, kahverengi renkli karbon tarafı yukarı bakacak şekilde kapak sürgüsünün üstündeki film üzerine yerleştirin. Ardından, slaytı ızgaralarla birlikte kızdırma boşaltma odasına yerleştirin ve 15 pikoamperdeki negatif ayarı kullanarak kapak slaytını yaklaşık 30 saniye boyunca kızdırın. Izgaraları kapak sürgüsünde, numuneyi ızgaralara eklemeden önce filtre kağıdı ile kaplı cam bir Petri kabının içinde saklayın.
Kızdırma deşarjı TEM ızgarasını cımbız kullanarak kapalı Petri kabından çıkarın ve karbon tarafı yukarı bakacak şekilde dairesel bir filtre kağıdına yerleştirin. Küçük bir spatula kullanarak, çok küçük bir toz kepçesini çıkarın ve filtre kağıdındaki TEM ızgarasının hemen yanındaki küçük bir kare cam kapak kayması üzerine yerleştirin. Tozun üzerine başka bir küçük kare cam slayt veya kapak kayması yerleştirin.
Parmaklarınızla, ince bir toz yapmak için iki cam slaytı hafifçe ovalayın. Kapak kaymalarını açın ve filtre kağıdındaki TEM ızgarasının hemen üzerine yerleştirin ve kapak kaymalarını parıltıdan boşaltılmış TEM ızgarasının sadece birkaç santimetre yukarısında ovalamaya devam edin. Tozun ızgaraya doğru düşüp düşmediğini gözlemleyin.
İki cam kapak fişinden birini çıkararak ince öğütülmüş tozu ortaya çıkarın. Daha sonra ince tozu kapak fişinden bir parça filtre kağıdı kullanarak TEM ızgarasına nazikçe fırçalayın. Bir dizi cımbız kullanarak TEM ızgarasının kenarını tutun ve uçların ızgara karelerinin hiçbirini delmediğinden emin olun.
Izgarayı filtre kağıdının bir ila iki santimetre yukarısına kaldırın ve ızgarayı aşağıdaki kağıda 90 derece açın. Gevşek tozları temizlemek için ızgarayı sıkıca cımbızlı tutarken cımbızlara hafifçe dokunun. Cımbızın ucunu ızgara ile doğrudan sıvı azot kabına elle hareket ettirerek ızgarayı dondurun ve ızgara ve cımbız kaynamayı bırakana kadar bekleyin.
Sıvı azot altında, ızgarayı numune tutucuya, karbon tarafı yönlendirilmiş olarak yerleştirin, böylece numune karbon destek filminden önce ışın tarafından vurulacaktır. Numune tutucuyu TEM'e yükleyerek ızgaranın her zaman sıvı azot sıcaklıklarında tutulmasını sağlayın. Otomatik yükleyici sistemleri için, kırpılmış ızgaraları sıvı azot soğutmalı bir kapta bir kasete yerleştirin, bu da otomatik yükleyici robotiklerinin kaseti kabul etmesini sağlarken numuneleri otomatik yükleyici ile sütun arasında sıkışmaya karşı güvende tutar.
TEM kolon vanalarını açın ve el panellerini kullanarak büyütmeyi mümkün olan en düşük büyütmeye ayarlayın. El panellerindeki yoğunluk düğmesini, floresan ekranda yuvarlak parlak bir alan görünecek şekilde ayarlayarak ışını bulun. Yüksek çözünürlüklü MicroED verilerini toplamadan önce mikroskobun hem düşük hem de yüksek büyütmeli görüntüleme için iyi hizalandığından emin olmak için uygun yazılımı kullanarak düşük büyütmede tüm ızgara atlasını alın.
Kırık karbon ve film üzerinde görünür siyah veya koyu tanecikler olmadan ızgara karelerini tanımlayın. El panellerindeki joystick'i fiziksel olarak kullanarak veya kırılmamış ve mikro kristaller içeren ızgara karelerini aramak için toplanan atlasın üzerinde sanal olarak ızgaranın etrafında gezinin. Bu karelerin her birinin merkezini, mikroskop kullanıcı arabiriminde veya mikroskop otomasyon yazılımında bir not defterine eklenebilecek araştırma için ızgara konumları listesine ekleyin.
Büyütme oranını 500 ile 1300x arasında ayarlayın. Depolanan her ızgara konumunda merkezsel yüksekliği ayarlayın ve kaydedilen z değerini belirtilen konumlara güncelleyin. Floresan ekranda veya düz bir kamerada ızgaradaki küçük siyah noktalar veya tanecikler için arama yapın.
İyi bir numune genellikle kristali sırayla düşündüren yüksek büyütmede keskin kenarlara sahip olacaktır. Yerleştirilmiş potansiyel bir kristali ekranın ortasına taşıyın ve büyütmeyi, TEM'in yüksek büyütme moduna girmesi için artırın. Seçilen alanın kristalden daha büyük olduğundan emin olmak için seçilen alan diyafram açıklığını daha büyük veya daha küçük bir boyuta değiştirin.
TEM el panellerindeki kırılma düğmesine basarak floresan eleğin takılı olduğundan emin olarak kırılma moduna geçin. Büyütme düğmesini kullanarak kamera uzunluğunu, kenar en az bir angstrom çözünürlüğü olacak şekilde ayarlayın. Kırınım odağını, merkezi nokta mümkün olduğunca keskin ve küçük olacak şekilde ayarlayın.
Kırınım kaydırma düğmelerini kullanarak, merkezi kirişi floresan ekranın ortasına getirin. Kirişin arkasında olduğundan emin olmak için ışın durdurmayı takın. Floresan ekranı kaldırın ve fotoğraf makinesine kısa bir pozlama yapın.
İlgili kırılma desenini inceleyin, desenin düzenli olarak sütunlar ve satırlar halinde düzenlenmiş keskin noktalara sahip olacağından emin olun. Kristal koordinatlarını TEM kullanıcı arayüzüne kaydedin veya bir yere yazın, ardından mevcut ızgara karesindeki tüm potansiyel kristaller için kırınım taramasını tekrarlayın. Elenmiş kristali 1000x'ten daha büyük bir büyütmede ortalayın ve kristalin merkezsel yüksekliğini otomatik bir rutin kullanarak veya elle ayarlayın.
Kristal boyutuna ve şekline en uygun seçili alan diyafram açıklığını yerleştirin. Görüntü ızgara çubukları tarafından tıkanana kadar sahne alanını negatif ve pozitif yönlerde eğin. Ayrıca, panjur okuma moduna sahip modern bir kamerada verileri her saniye okuyarak veri toplama amacıyla bu açıları not edin.
Maksimum eğme hızının yüzdesini ve mikroskop kullanıcı arayüzünde veya özel yazılımda ne zaman durulacağını belirterek dönüş hızını ayarlayın. Verileri tek tek kareler veya bir görüntü yığını olarak çeşitli biçimlerde kaydedin. Mikro kristallerden toplanan kristalografik formattaki bir kırılma filmi, bir TEM ızgarasında tanımlanan bir karbamazepin mikro kristalinden sürekli dönen bir MicroED veri kümesini gösterir.
Veri toplama, tümleştirme ve yapı çözümünden sonra, yüksek çözünürlüklü bir yapı belirlenir ve netliği, verilerin kalitesine ve eksiksizliğine bağlıdır. Numunenin ızgaraya uygulanması, iyi veriler elde etmek için kritik öneme sahiptir. Bu yöntemi takiben, veriler standart kristalografik yazılım kullanılarak daha fazla işlenebilir.
MicroED'in küçük moleküller için güçlü bir yöntem olduğunu göstermek, kritik öneme sahip moleküllerin yeni yapılarını çözmek için dünya çapında kullanımını açmıştır.
