In questa procedura, mostriamo come procedere da una piccola molecola in polvere a una struttura tridimensionale in pochi minuti. Questa è una tecnica trasformativa per la comunità chimica. Molti composti non crescono facilmente in grandi cristalli.
Con MicroED, possiamo determinare strutture di risoluzione atomica da cristalli di dimensioni nanometriche. A dimostrare la procedura sarà il Dr.Mike Martynowycz, professore alla UCLA. Per iniziare, trasferire una piccola quantità di polvere, liquido o solido in una piccola fiala o tubo.
Per i campioni già in polvere, sigillare il tubo usando il tappo fino a quando il campione è necessario. Allo stesso modo, asciugare i campioni liquidi in polvere. Avvolgere la pellicola di plastica attorno a un'estremità di un vetrino di copertura.
Posizionare le griglie TEM sulla pellicola sopra la diapositiva del coperchio con il lato in carbonio di colore marrone rivolto verso l'alto. Quindi, posizionare il vetrino con le griglie nella camera di scarico del bagliore e scaricare il vetrino del coperchio per circa 30 secondi utilizzando l'impostazione negativa a 15 picoamperes. Conservare le griglie sul vetrino di copertina all'interno di una piastra di Petri di vetro rivestita con carta da filtro prima di aggiungere il campione alle griglie.
Rimuovere la griglia TEM a scarica di bagliore dalla capsula di Petri coperta usando una pinzetta e posizionarla su una carta da filtro circolare con il lato in carbonio rivolto verso l'alto. Usando una piccola spatola, rimuovere un pallino molto piccolo di polvere e posizionarlo su un piccolo vetrino quadrato di vetro proprio accanto alla griglia TEM sulla carta da filtro. Posizionare un altro piccolo vetrino quadrato o un foglietto di copertura sopra la polvere.
Con le dita, strofinare delicatamente i due vetrini di vetro insieme per ottenere una polvere fine. Inclinare le diapositive del coperchio e posizionarle appena sopra la griglia TEM sulla carta da filtro e continuare a strofinare le diapositive del coperchio insieme a pochi centimetri sopra la griglia TEM scaricata a bagliore. Osserva se la polvere sta cadendo verso la griglia.
Scoprire la polvere finemente macinata rimuovendo uno dei due vetrini di copertura. Quindi spazzolare delicatamente la polvere fine dalla linguetta di copertura sulla griglia TEM usando un pezzo di carta da filtro. Afferrare il bordo della griglia TEM utilizzando un set di pinzette, assicurandosi che le punte non forino nessuno dei quadrati della griglia.
Sollevare la griglia da uno a due centimetri sopra la carta da filtro e inclinare la griglia di 90 gradi rispetto alla carta sottostante. Picchiettare delicatamente le pinzette mantenendo la griglia saldamente intrecciata per rimuovere la polvere sciolta. Congelare la griglia spostando a mano la punta delle pinzette con la griglia direttamente in un contenitore di azoto liquido e attendere che la griglia e le pinzette smettano di bollire.
Sotto azoto liquido, posizionare la griglia nel supporto del campione con il lato del carbonio orientato in modo tale che il campione venga colpito dal fascio prima del film di supporto del carbonio. Caricare il portacampioni nel TEM assicurandosi che la griglia sia sempre mantenuta a temperature di azoto liquido. Per i sistemi di caricamento automatico, posizionare le griglie tagliate in una cassetta in un contenitore raffreddato ad azoto liquido, che consente alla robotica del caricatore automatico di accettare la cassetta mantenendo i campioni sicuri per la spola tra il caricatore automatico e la colonna.
Aprire le valvole a colonna TEM e regolare l'ingrandimento utilizzando i pannelli manuali al minor ingrandimento possibile. Trova il raggio regolando la manopola dell'intensità sui pannelli manuali in modo che un'area luminosa rotonda sia visibile sullo schermo fluorescente. Prendere un atlante a griglia a basso ingrandimento utilizzando un software appropriato che assicura che il microscopio sia ben allineato per l'imaging a basso e alto ingrandimento prima di raccogliere dati MicroED ad alta risoluzione.
Identificare i quadrati della griglia senza carbonio rotto e grani neri o scuri visibili sul film. Naviga intorno alla griglia fisicamente usando il joystick sui pannelli delle mani o virtualmente sull'atlante raccolto per cercare i quadrati della griglia che non sono rotti e contengono micro cristalli. Aggiungi il centro di ciascuno di questi quadrati a un elenco di posizioni della griglia per l'indagine, che può essere aggiunto a un taccuino nell'interfaccia utente del microscopio o nel software di automazione del microscopio.
Impostare l'ingrandimento tra 500 e 1300x. Regolare l'altezza centrale in ogni posizione della griglia memorizzata e aggiornare il valore z salvato nelle posizioni annotate. Cerca sullo schermo fluorescente o su una fotocamera piatta piccole macchie nere o grani sulla griglia.
Un buon campione avrà spesso spigoli vivi ad alto ingrandimento che suggeriscono il cristallo in ordine. Spostare un cristallo potenziale posizionato al centro dello schermo e aumentare l'ingrandimento in modo che il TEM entri in modalità di ingrandimento elevato. Inserire un'apertura dell'area selezionata e impostarla su una dimensione maggiore o minore per assicurarsi che l'area selezionata sia più grande del cristallo.
Passare alla modalità di defrazione premendo il pulsante di defrazione sui pannelli manuali TEM per assicurarsi che lo schermo fluorescente sia inserito. Regolare la lunghezza della fotocamera utilizzando la manopola di ingrandimento in modo che il bordo abbia almeno una risoluzione angstrom. Regolare la messa a fuoco di diffrazione in modo che il punto centrale sia il più nitido e piccolo possibile.
Utilizzando le manopole del cambio di diffrazione, spostare il fascio centrale al centro dello schermo fluorescente. Inserire l'arresto del raggio assicurandosi che il raggio sia dietro di esso. Sollevare lo schermo fluorescente e fare una breve esposizione sulla fotocamera.
Ispezionare il modello di defrazione corrispondente, assicurandosi che il modello abbia punti acuti disposti regolarmente in colonne e righe. Salva le coordinate dei cristalli nell'interfaccia utente TEM o scrivendole, quindi ripeti lo screening di diffrazione per tutti i potenziali cristalli di interesse sul quadrato della griglia corrente. Centrare il cristallo schermato con un ingrandimento superiore a 1000x e regolare l'altezza centrica del cristallo utilizzando una routine automatica o a mano.
Inserire l'apertura dell'area selezionata che meglio si adatta alle dimensioni e alla forma del cristallo. Inclinare lo stage nelle direzioni negativa e positiva fino a quando l'immagine non viene occlusa dalle barre della griglia. E nota questi angoli per scopi di raccolta dati leggendo i dati ogni secondo su una fotocamera moderna con una modalità di lettura rolling shutter.
Impostare la velocità di rotazione specificando la percentuale della velocità massima di inclinazione e quando fermarsi nell'interfaccia utente del microscopio o nel software dedicato. Salva i dati in una varietà di formati dice singoli fotogrammi o come una pila di immagini. Un filmato di defrazione in formato cristallografico raccolto da microcristalli mostra un set di dati MicroED a rotazione continua da un microcristallo di carbamazepina identificato su una griglia TEM.
Dopo la raccolta, l'integrazione e la soluzione della struttura dei dati, viene determinata una struttura ad alta risoluzione e la sua chiarezza dipende dalla qualità e dalla completezza dei dati. L'applicazione del campione alla griglia è fondamentale per acquisire dati validi. Seguendo questo metodo, i dati possono essere ulteriormente elaborati utilizzando un software cristallografico standard.
Dimostrare che MicroED è un metodo potente per piccole molecole ha aperto il suo uso in tutto il mondo per risolvere nuove strutture di molecole di importanza critica.
