이 절차에서는 소분자 분말에서 3차원 구조로 몇 분 안에 진행하는 방법을 보여줍니다. 이것은 화학 커뮤니티를 위한 혁신적인 기술입니다. 많은 화합물은 쉽게 큰 결정으로 성장하지 않습니다.
MicroED를 사용하면 나노미터 크기의 결정에서 원자 분해능 구조를 결정할 수 있습니다. 절차를 시연하는 것은 UCLA의 교수 인 Mike Martynowycz 박사가 될 것입니다. 시작하려면 소량의 분말, 액체 또는 고체를 작은 바이알이나 튜브에 옮깁니다.
이미 분말 형태의 샘플의 경우 샘플이 필요할 때까지 캡을 사용하여 튜브를 밀봉합니다. 유사하게, 액체 샘플을 분말로 건조시킨다. 유리 커버 슬라이드의 한쪽 끝에 플라스틱 필름을 감습니다.
TEM 그리드를 갈색 탄소 면이 위를 향하도록 하여 커버 슬라이드 상단의 필름에 놓습니다. 그런 다음 그리드가 있는 슬라이드를 글로우 방전 챔버에 넣고 30피코암페어에서 음수 설정을 사용하여 약 15초 동안 커버 슬라이드를 글로우 방전합니다. 그리드에 샘플을 추가하기 전에 여과지가 늘어선 유리 페트리 접시 내부의 커버 슬라이드에 그리드를 보관하십시오.
핀셋을 사용하여 덮인 페트리 접시에서 글로우 방전 TEM 그리드를 제거하고 탄소 면이 위를 향하도록 하여 원형 여과지에 놓습니다. 작은 주걱을 사용하여 아주 작은 스쿱의 분말을 제거하고 여과지의 TEM 그리드 바로 옆에 있는 작은 정사각형 유리 커버 슬립에 놓습니다. 분말 위에 또 다른 작은 정사각형 유리 슬라이드 또는 커버 슬립을 놓습니다.
손가락으로 두 개의 유리 슬라이드를 부드럽게 문질러 미세한 가루를 만듭니다. 커버 슬립의 각도를 조정하고 여과지의 TEM 그리드 바로 위에 배치하고 글로우 방전 TEM 그리드 바로 위에 커버 슬립을 계속 문지릅니다. 분말이 그리드 쪽으로 떨어지는지 관찰합니다.
두 개의 유리 커버 슬립 중 하나를 제거하여 잘게 분쇄된 분말을 추출합니다. 그런 다음 여과지를 사용하여 덮개 슬립에서 미세 분말을 TEM 그리드로 부드럽게 털어냅니다. 핀셋 세트를 사용하여 TEM 그리드의 가장자리를 잡고 팁이 그리드 사각형에 구멍을 뚫지 않도록 합니다.
그리드를 여과지 위로 1-2cm 들어 올리고 그리드를 아래 용지에 대해 90도 각도로 기울입니다. 그리드를 단단히 핀셋으로 유지하면서 핀셋을 부드럽게 두드려 느슨한 가루를 제거합니다. 그리드가 있는 핀셋 끝을 손으로 액체 질소 용기에 직접 움직여 그리드를 얼리고 그리드와 핀셋이 끓는 것을 멈출 때까지 기다립니다.
액체 질소 하에서, 샘플이 탄소 지지 필름 전에 빔에 부딪히도록 탄소 측면이 방향이 되도록 샘플 홀더에 그리드를 놓습니다. 샘플 홀더를 TEM에 로드하여 그리드가 항상 액체 질소 온도로 유지되도록 합니다. 자동 로더 시스템의 경우, 잘린 그리드를 액체 질소 냉각 용기의 카세트에 넣으면 자동 로더 로봇이 자동 로더와 컬럼 사이를 이동할 수 있도록 샘플을 안전하게 유지하면서 카세트를 수용할 수 있습니다.
TEM 컬럼 밸브를 열고 핸드 패널을 사용하여 가능한 가장 낮은 배율로 배율을 조정합니다. 형광 스크린에 둥글고 밝은 영역이 보이도록 핸드 패널의 강도 노브를 조정하여 빔을 찾습니다. 고해상도 MicroED 데이터를 수집하기 전에 적절한 소프트웨어를 사용하여 저배율의 모든 그리드 아틀라스를 사용하여 현미경이 저배율 및 고배율 이미징 모두에 대해 잘 정렬되도록 합니다.
필름에 깨진 탄소와 눈에 띄는 검은색 또는 어두운 입자가 없는 격자 사각형을 식별합니다. 핸드 패널의 조이스틱을 사용하여 물리적으로 그리드를 탐색하거나 수집된 아틀라스에서 가상으로 그리드를 탐색하여 깨지지 않고 미세 결정이 포함된 그리드 사각형을 검색합니다. 이러한 각 사각형의 중심을 조사를 위해 그리드 위치 목록에 추가하면 현미경 사용자 인터페이스 또는 현미경 자동화 소프트웨어의 노트북에 추가할 수 있습니다.
배율을 500에서 1300x 사이로 설정합니다. 저장된 각 그리드 위치에서 중심 높이를 조정하고 저장된 z-값을 기록된 위치로 업데이트합니다. 형광 화면이나 평면 카메라에서 그리드의 작은 검은 점이나 입자를 검색합니다.
좋은 샘플은 종종 고배율에서 날카로운 모서리를 가지며 결정을 순서대로 암시합니다. 위치된 전위 수정을 화면 중앙으로 이동하고 TEM이 고배율 모드로 들어가도록 배율을 높입니다. 선택한 영역 조리개를 삽입하고 조리개를 더 크거나 작은 크기로 변경하여 선택한 영역이 크리스탈보다 커지도록 합니다.
형광 스크린이 삽입되었는지 확인하는 TEM 핸드 패널의 굴절 버튼을 눌러 굴절 모드로 전환합니다. 확대 노브를 사용하여 가장자리가 옹스트롬 해상도 이상이 되도록 카메라 길이를 조정합니다. 중심 지점이 가능한 한 선명하고 작도록 회절 초점을 조정합니다.
회절 이동 노브를 사용하여 중앙 빔을 형광 스크린의 중앙으로 이동합니다. 빔이 뒤에 있는지 확인하면서 빔 스톱을 삽입하십시오. 형광등을 들어 올리고 카메라에 짧은 노출을 취합니다.
해당 굴절 패턴을 검사하여 패턴에 열과 행에 규칙적으로 배열된 날카로운 점이 있는지 확인합니다. TEM 사용자 인터페이스에 결정 좌표를 저장하거나 기록한 다음 현재 그리드 사각형에서 관심 있는 모든 잠재적 결정에 대해 회절 스크리닝을 반복합니다. 차폐된 크리스탈을 1000x보다 큰 배율로 중앙에 놓고 자동 루틴을 사용하거나 손으로 크리스탈의 중심 높이를 조정합니다.
크리스탈 크기와 모양에 가장 잘 맞는 선택한 영역 조리개를 삽입합니다. 스테이지를 음수 및 양수 방향으로 기울여 이미지가 격자 막대에 의해 가려질 때까지 진행합니다. 그리고 롤링 셔터 판독 모드가 있는 최신 카메라에서 1초마다 데이터를 읽어 데이터 수집을 위해 이러한 각도를 기록해 두십시오.
현미경 사용자 인터페이스 또는 전용 소프트웨어에서 최대 틸트 속도의 백분율과 정지 시점을 지정하여 회전 속도를 설정합니다. 데이터를 다양한 형식으로 저장하면 개별 프레임 또는 이미지 스택으로 저장됩니다. 마이크로 결정에서 수집된 결정학적 형식의 굴절 영화는 TEM 그리드에서 식별된 카르바마제핀 마이크로 결정의 연속 회전 MicroED 데이터 세트를 보여줍니다.
데이터 수집, 통합 및 구조 솔루션 후 고해상도 구조가 결정되며 그 명확성은 데이터의 품질과 완전성에 달려 있습니다. 그리드에 샘플을 적용하는 것은 좋은 데이터를 얻는 데 중요합니다. 이 방법에 따라 표준 결정학 소프트웨어를 사용하여 데이터를 추가로 처리할 수 있습니다.
MicroED가 소분자에 대한 강력한 방법임을 입증함으로써 매우 중요한 분자의 새로운 구조를 해결하는 데 전 세계적으로 사용되었습니다.
