体内 熟练运动行为的无线光遗传学控制

目前的方案有助于研究熟练运动行为背后的大脑机制。无线光遗传学允许操纵特定的神经元，而受试者在自由运动中执行任务。结合高速摄像，可以对精细运动行为进行详细分析。

该方法可以帮助理解神经发育和神经退行性疾病的运动问题。这些技术也可用于研究其他行为范式中的大脑功能。来自我实验室的本科生Diana Rodriguez-Munoz将协助实验。

对于外科手术，首先根据目标结构的背腹坐标准备所需长度的LED套管。为此，将玻璃纤维切割成比最终所需尺寸更长的长度，并用粗糙的砂纸将纤维尖端研磨至目标长度。然后，用细砂纸抛光纤维尖端。

对于显微注射，用矿物油填充移液器，并将移液器放入显微注射器中。通过注入一些矿物油来确保显微注射器正常工作。接下来，通过应用眼药膏并用修剪器和脱毛膏从头皮上去除毛发来准备麻醉小鼠进行手术。

然后，用含有8%聚维酮碘和70%乙醇的棉签擦拭头皮，各交替三次。消毒后，将小鼠置于立体定位装置中并固定头部，确保颅骨在内侧和前后轴上水平。使用手术刀沿着矢状轴在眼睛水平处的头皮上做一个一厘米的切口。

然后，缩回皮肤以暴露颅骨并用棉签清洁骨膜。用盐水溶液和棉签清洁颅骨表面，并使用无菌吸收性眼矛解决表面的任何出血。然后，用棉签滴下2.5%的过氧化氢，让它作用几秒钟，使颅骨缝合线可见并具有更好的参考。

几秒钟后，用干净的棉签彻底清洁该区域。使用最终尖端直径为15微米的玻璃移液器，定位前凸和λ，以检查颅骨是否在前后轴上水平。然后，使用标记在所选坐标上方的头皮上绘制一个参考点。

在参考点，使用小而圆的牙钻头，用旋转工具以低到中速对颅骨施加轻柔的压力，进行一毫米直径的开颅手术。完成后，将毛细血管向选定的前后坐标（AP）和内侧坐标（ML）移动。在毛细管中加载300至400纳升的CreE依赖性腺相关病毒或AAV，例如AAV1，D-flox通道视紫红质mCherry以表达感兴趣区域的通道视紫红质。

AAV可用作表达报告蛋白的对照。在确保尖端不堵塞后，在背侧纹状体的背腹侧减去3.35毫米坐标处将玻璃移液器引入大脑，并使用自动注射器以每秒23纳升的速度注射200纳升病毒。注射后等待10分钟，然后缓慢取出玻璃移液器，以避免溢出。

然后，用棉签清洁并干燥任何残留物。接下来，将玻璃LED套管连接到立体定位臂上，并使用bregma作为参考校准坐标。然后，缓慢插入套管以避免组织损伤，并将其放置在注射部位上方100微米处。

一旦LED套管就位，在开颅手术边缘加入一滴100微升的组织粘合剂。使用无菌刷子将新鲜制备的牙科水泥混合物一点一点地涂抹在套管连接器周围，构建层，直到颅骨被覆盖并且连接器牢固地连接到颅骨上，使针脚完全自由。当水泥完全干燥时，使用组织粘合剂关闭植入物周围的皮肤。

然后，将小鼠置于33摄氏度加热垫上的恢复笼中，同时监测不适或疼痛的迹象。用普通相机记录动物的行为，并从腔室前部每秒捕获30至60帧。可以在训练室下方以45度角放置一面镜子，以监测动物的姿势。

当小鼠开始到达颗粒时，用遥控器手动转动LED套管，以便在执行行为不超过两秒钟的时间内进行连续刺激。刺激装置触发470纳米的LED，强度为每毫米平方1毫瓦。通过伸手抓取任务研究了动物在光遗传学操作下的精细运动行为。

小鼠在几天内学会了执行任务，并达到了超过55%的准确率，经过五天的训练后达到了高原。通过高速摄像跟踪运动轨迹，从而可以分析运动学。对行进距离、速度、加速度、终点和轨迹等参数进行可量化评估。

在错过的试验中，小鼠开始比命中试验更远离颗粒的抓取运动。此外，错误与小鼠姿势显着相关，通过命中和错过试验期间身体角度的差异来显示。与对照条件相比，表达D1多巴胺的多刺投射神经元（SPN）的对侧激活降低了抓取成功率。

在光遗传学刺激期间，爪子轨迹在行进距离上增加，导致无法瞄准颗粒并且初始误差类型1增加。主成分分析（PCA）表明，对侧D1 SPN激活期间的所有试验轨迹都分离成一个集群，与对照集群几乎没有重叠，表明相似性较低。PCA分析显示，同侧DSPN的激活导致轨迹色散增加。

因此，同侧D1 SPN激活在不改变行为结果的情况下修改了到达轨迹。执行此方案时，请注意正确放置套管，以免在训练期间脱落。这种方法可用于其他行为范式，以研究运动行为，感觉处理，学习和记忆。

无线光遗传学将允许在真正自由移动的受试者中研究自然主义行为及其神经生物学基础。