La edición de ARN juega un papel crítico en las enfermedades humanas. Los científicos están encontrando una aplicación infinita en los medicamentos. Este protocolo demuestra la aplicación de la tecnología de electroforesis de temperatura portátil como un enfoque de no secuenciación para la identificación rápida y confiable de la modificación de ARN en la edición de ARN sin la necesidad de secuenciación directa de ARN.
Se utilizó el enfoque basado en la electroforesis micro tTG para caracterizar las diferencias entre el perfil de fusión de cuatro fragmentos de ARN editados y sus correspondientes fragmentos no editados. Se utilizaron las puntuaciones de similitud del patrón para evaluar la reproducibilidad del método. Esta plataforma permite la detección incluso de sustitución de base única en ARN, de manera directa, simple y rentable.
Se anticipa que esta herramienta analítica ayudará a nuevos hallazgos en biología molecular Comenzar identificando fragmentos de genes con diferentes perfiles de fusión y generar curvas de fusión predichas utilizando la herramienta basada en la web Umelt HETS. Diseñe tres pares de 300 a 324 fragmentos de genes de pares de bases para cada gen objetivo. Seleccione el par no editado o editado que muestra la diferencia máxima entre las regiones de fusión en el eje de helicidad para un análisis más detallado.
Para el análisis micro-TGGE, sintetice el fragmento de gen seleccionado mediante amplificación por PCR. Diseñe los cebadores hacia adelante y hacia atrás utilizando el software de dinamo de ADN, y verifique la secuencia de imprimación utilizando la herramienta NCBI Primer-BLAST. Extraer el ARN total de la fuente de genes editados y no editados utilizando métodos estándar.
Sintetizar el ADNc correspondiente, preparar 20 microlitros de la mezcla de reacción de PCR y configurar la PCR como se describe en el manuscrito de texto. Luego, mezcle seis microlitros del producto PCR con tres microlitros de tinte de carga de gel 6x en un tubo de 250 microlitros, y componga el volumen total a 12 microlitros con agua estéril. Guarde el producto de PCR a 25 grados centígrados hasta su uso posterior.
Para ensamblar los casetes de gel, coloque la placa de gel superior entre las otras dos placas en el soporte de casete de gel para la polimerización del gel. Para preparar el gel de poliacrilamida, agregue 7,2 gramos de urea a un tubo de 50 mililitros y disuelva en 10 mililitros de agua estéril. Calentar la muestra en un microondas durante 20 a 30 segundos.
Y deja que se enfríe a temperatura ambiente. Agregue tres mililitros de tampón TBE 5x, 2.25 mililitros de acrilamida bis, 75 microlitros de persulfato de amonio 10x y 15 microlitros de TEMED a la solución. Vierta la solución de gel en el soporte del cassette de gel lentamente en un ángulo inclinado para evitar burbujas de aire.
Después de unos 30 minutos, desmonte los casetes de gel y límpielos. Utilice el aparato micro-TGGE con un gradiente de temperatura establecido perpendicularmente a la dirección de la migración del ADN. Remoje las almohadillas tampón de electroforesis superior e inferior en dos mililitros de tampón TBE 1x.
Coloque el cassette de gel en la unidad de cámara de electroforesis horizontal y coloque las almohadillas tampón superior e inferior. Luego cargue 10 microlitros del producto de PCR en el pozo medio y un microlitro del producto de PCR en cada pozo lateral. Espere un minuto, conecte la unidad de alimentación y suministre 100 voltios durante 12 minutos a un gradiente de temperatura lineal de 15 a 65 grados centígrados.
Una vez finalizada la ejecución. saque el cassette y retire la tapa superior de vidrio. Vierta 300 microlitros de 10x tinción SYBR Gold sobre el gel.
Visualice los perfiles de fusión utilizando la linterna LED azul instalada en el dispositivo electroforético del tamaño de la palma de la mano. Repita cada experimento electroforético tres veces para confirmar la reproducibilidad de los datos. Descargue y abra el software del analizador micro-TGGE.
Abra el archivo JPEG que contiene la imagen del gel. Haga clic en el botón "marco" y seleccione el marco apropiado de la imagen del gel. Haga clic en el botón "corrección de coordenadas" y agregue dos puntos de referencia.
Haga clic en el botón "Adición de puntos de característica" y agregue puntos de muestra. Luego, guarde los datos de imagen de gel procesados en formato micro-TGGE. Haga clic en el botón de muestra y seleccione la opción de búsqueda de puntos simples para comparar dos o más imágenes.
Para el tipo de edición de ARN de C a U, la muestra no editada con la cBase original mostró un patrón de fusión más largo en el punto de fusión final de la hebra que la muestra editada con la base U modificada. Para el tipo de edición de ARN de A a I, la muestra editada con la base G modificada mostró un patrón de fusión más largo en el punto de fusión del extremo de la hebra que la muestra no editada con la base A original. Para el tipo de edición inversa de ARN de U a C, la muestra editada en el primer gen con la base C modificada mostró un patrón de fusión más largo entre los puntos de fusión inicial y final de la hebra que la muestra no editada con la base U original.
Sin embargo, no se observó un patrón similar para el otro gen. Las puntuaciones de similitud de patrones de los tipos de edición de ARN de C a U y de A a I fueron más bajas que las de los dos tipos de edición de ARN de U a C. Esta diferencia probablemente estaba relacionada con las ubicaciones respectivas de los sitios de edición.
El análisis hets de uMelt mostró que la modificación de C a U desplazaría la curva de fusión hacia la izquierda a lo largo del eje de temperatura. Las puntuaciones de similitud de patrones calculadas a partir de análisis micro-TGGE de los fragmentos no editados y los tres editados fueron consistentes con los resultados predichos utilizando uMelt. La optimización del fragmento de gen objetivo es fundamental para una clara diferenciación entre la razón editada y no editada.
Y este proceso se ha simplificado en el protocolo actual.
