גישת אי-ריצוף לגילוי מהיר של עריכת RNA

עריכת RNA ממלאת תפקיד קריטי במחלות אנושיות. מדענים מוצאים יישום אינסופי בתרופות. פרוטוקול זה מדגים את היישום של טכנולוגיית אלקטרופורזה בטמפרטורה ניידת כגישה שאינה ריצוף לזיהוי מהיר ואמין של שינוי RNA בעריכת RNA ללא צורך בריצוף RNA ישיר.

הגישה מבוססת האלקטרופורזה של מיקרו tTG שימשה לאפיון ההבדלים בין פרופיל ההיתוך של ארבעה מקטעי RNA ערוכים לבין הקטעים הלא ערוכים המתאימים להם. ציוני הדמיון בדפוס שימשו להערכת יכולת השכפול של השיטה. פלטפורמה זו מאפשרת זיהוי של אפילו החלפה חד-פעמית ב-RNA, בצורה פשוטה, פשוטה וחסכונית.

הצפי הוא שכלי אנליטי זה יסייע לממצאים חדשים בביולוגיה מולקולרית בגין על ידי זיהוי שברי גנים בעלי פרופילי התכה שונים וייצור עקומות התכה חזויות באמצעות הכלי מבוסס האינטרנט Umelt HETS. תכנן שלושה זוגות של 300 עד 324 שברי גנים של זוגות בסיסים עבור כל גן מטרה. בחר את הזוג שאינו ערוך או ערוך המציג את ההבדל המרבי בין אזורי ההיתוך בציר ההליקיטי לניתוח נוסף.

לניתוח micro-TGGE, סינתזו את מקטע הגן שנבחר על ידי הגברת PCR. תכנן את הפריימרים קדימה ואחורה באמצעות תוכנת דינמו DNA, ואמת את רצף הפריימרים באמצעות הכלי NCBI Primer-BLAST. חלץ רנ"א כולל ממקור של גנים ערוכים ולא ערוכים בשיטות סטנדרטיות.

סינתזו את ה-cDNA המתאים, הכינו 20 מיקרוליטרים של תערובת תגובת ה-PCR והגדירו את ה-PCR כמתואר בכתב היד של הטקסט. לאחר מכן, יש לערבב שישה מיקרוליטרים של מוצר ה-PCR עם שלושה מיקרוליטרים של צבע העמסת ג'ל 6x בצינור 250 מיקרוליטר, ולהרכיב את הנפח הכולל ל-12 מיקרוליטרים עם מים סטריליים. אחסנו את מוצר ה-PCR בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס עד לשימוש נוסף.

כדי להרכיב את קלטות הג'ל, יש לכרוך את צלחת הג'ל העליונה בין שתי הצלחות האחרות במחזיק קלטות הג'ל לפילמור ג'ל. כדי להכין את ג'ל פולי אקרילאמיד, להוסיף 7.2 גרם של אוריאה לצינור 50 מיליליטר ולהמיס ב 10 מיליליטר של מים סטריליים. מחממים את הדגימה במיקרוגל למשך 20 עד 30 שניות.

ותנו לו להתקרר לטמפרטורת החדר. הוסף שלושה מיליליטרים של חיץ TBE 5x, 2.25 מיליליטרים של אקרילמיד ביס, 75 מיקרוליטרים של 10x אמוניום פרסולפט, ו -15 מיקרוליטרים של TEMED לתמיסה. יוצקים את תמיסת הג'ל למחזיק קלטות הג'ל באיטיות בזווית מוטה כדי למנוע בועות אוויר.

לאחר כ-30 דקות, מפרקים את קלטות הג'ל ומנקים אותן. השתמש במנגנון micro-TGGE עם שיפוע טמפרטורה שנקבע בניצב לכיוון נדידת הדנ"א. משרים את רפידות המאגר העליונות והתחתונות של אלקטרופורזה בשני מיליליטרים של חיץ TBE 1x.

מניחים את קלטת הג'ל ביחידת תא האלקטרופורזה האופקית, וממקמים את רפידות החיץ העליונות והתחתונות. לאחר מכן העמיסו 10 מיקרוליטרים של מוצר ה-PCR לתוך הבאר האמצעית, ומיקרוליטר אחד של מוצר ה-PCR לכל באר צדדית. המתן דקה, חבר את יחידת הכוח וספק 100 וולט במשך 12 דקות בשיפוע טמפרטורה ליניארי של 15 עד 65 מעלות צלזיוס.

לאחר סיום הריצה. להוציא את הקלטת ולהסיר את כיסוי הזכוכית העליון. יוצקים 300 מיקרוליטרים של כתם זהב SYBR 10x על הג'ל.

דמיינו את פרופילי ההיתוך באמצעות פנס ה-LED הכחול המותקן בהתקן האלקטרופורטי בגודל כף היד. חזור על כל ניסוי אלקטרופורטי שלוש פעמים כדי לאשר את יכולת השכפול של הנתונים. הורד ופתח את תוכנת האנליזה micro-TGGE.

פתח את קובץ JPEG המכיל את תמונת הג'ל. לחץ על כפתור המסגרת ובחר את המסגרת המתאימה של תמונת הג'ל. לחץ על כפתור תיקון הקואורדינטות והוסף שתי נקודות ייחוס.

לחץ על תוספת של לחצן נקודות תכונה והוסף נקודות לדוגמה. לאחר מכן, שמור את נתוני תמונת הג'ל המעובדים בפורמט micro-TGGE. לחץ על כפתור הדוגמה ובחר באפשרות חיפוש אחר נקודות פשוטות כדי להשוות בין שתי תמונות או יותר.

עבור סוג העריכה של C-to-U RNA, הדגימה הלא ערוכה עם cBase המקורי, הראתה תבנית התכה ארוכה יותר בנקודת ההיתוך של קצה הגדיל מאשר הדגימה הערוכה עם בסיס U שהשתנה. עבור סוג עריכת ה-A-to-I RNA, הדגימה הערוכה עם בסיס ה-G שהשתנה, הציגה תבנית התכה ארוכה יותר בנקודת ההיתוך בקצה הגדיל מאשר הדגימה הלא ערוכה עם בסיס A המקורי. עבור סוג העריכה ההפוך של U-to-C RNA, הדגימה הערוכה בגן הראשון עם בסיס C שהשתנה הראתה דפוס התכה ארוך יותר בין נקודות ההיתוך הראשוניות והקצה של הגדיל מאשר הדגימה הלא ערוכה עם בסיס U המקורי.

עם זאת, דפוס דומה לא נצפה עבור הגן האחר. ציוני הדמיון בין התבניות של סוגי העריכה C-to-you ו-A-to-I RNA היו נמוכים יותר מאלה של שני סוגי העריכה של U-to-C RNA. הבדל זה היה קשור ככל הנראה למיקומים המתאימים של אתרי העריכה.

ניתוח ה-HETS של uMelt הראה שהשינוי מ-C-to-U יזיז את עקומת ההיתוך שמאלה לאורך ציר הטמפרטורה. ציוני הדמיון בין התבניות שחושבו מניתוחי מיקרו-TGGE של הלא-ערוכים ושלושת הקטעים הערוכים היו עקביים עם התוצאות שנחזו באמצעות uMelt. אופטימיזציה של מקטע גן המטרה היא קריטית להבחנה ברורה בין הסיבה הערוכה והלא ערוכה.

ותהליך זה כבר פשוט יותר בפרוטוקול הנוכחי.