RNA-Editing spielt eine entscheidende Rolle bei menschlichen Erkrankungen. Wissenschaftler finden endlose Anwendung in den Medikamenten. Dieses Protokoll demonstriert die Anwendung der tragbaren Temperaturelektrophorese-Technologie als Nicht-Sequenzierungsansatz für die schnelle und zuverlässige Identifizierung der RNA-Modifikation in der RNA-Editierung ohne die Notwendigkeit einer direkten RNA-Sequenzierung.
Der auf Mikro-tTG-Elektrophorese basierende Ansatz wurde verwendet, um die Unterschiede zwischen dem Schmelzprofil von vier editierten RNA-Fragmenten und ihren entsprechenden nicht editierten Fragmenten zu charakterisieren. Die Musterähnlichkeitswerte wurden verwendet, um die Reproduzierbarkeit der Methode zu beurteilen. Diese Plattform ermöglicht den Nachweis sogar einer einzelbasierten Substitution in RNAs auf unkomplizierte, einfache und kostengünstige Weise.
Es wird erwartet, dass dieses Analysewerkzeug neue Erkenntnisse in der Molekularbiologie unterstützen wird Beginnen Sie mit der Identifizierung von Genfragmenten mit unterschiedlichen Schmelzprofilen und generieren Sie vorhergesagte Schmelzkurven mit dem webbasierten Tool Umelt HETS. Entwerfen Sie drei Paare von 300 bis 324 Basenpaar-Genfragmenten für jedes Zielgen. Wählen Sie das nicht bearbeitete oder bearbeitete Paar aus, das die maximale Differenz zwischen den Schmelzbereichen auf der Helizitätsachse zur weiteren Analyse anzeigt.
Für die Mikro-TGGE-Analyse wird das ausgewählte Genfragment mittels PCR-Amplifikation synthetisiert. Entwerfen Sie die Vorwärts- und Rückwärtsprimer mit der DNA-Dynamo-Software und überprüfen Sie die Primersequenz mit dem NCBI Primer-BLAST-Tool. Extrahieren Sie die gesamte RNA aus der Quelle der editierten und nicht editierten Gene mit Standardmethoden.
Synthetisieren Sie die entsprechende cDNA, bereiten Sie 20 Mikroliter der PCR-Reaktionsmischung vor und richten Sie die PCR wie im Textmanuskript beschrieben ein. Mischen Sie dann sechs Mikroliter des PCR-Produkts mit drei Mikrolitern 6x Gelladefarbstoff in einem 250-Mikroliter-Röhrchen und machen Sie das Gesamtvolumen mit sterilem Wasser auf 12 Mikroliter aus. Lagern Sie das PCR-Produkt bei 25 Grad Celsius bis zur weiteren Verwendung.
Um die Gelkassetten zu montieren, legen Sie die obere Gelplatte zwischen die beiden anderen Platten in den Gelkassettenhalter zur Gelpolymerisation. Um das Polyacrylamid-Gel herzustellen, fügen Sie 7,2 Gramm Harnstoff zu einem 50-Milliliter-Röhrchen hinzu und lösen Sie es in 10 Milliliter sterilem Wasser auf. Erhitzen Sie die Probe in einer Mikrowelle für 20 bis 30 Sekunden.
Und auf Raumtemperatur abkühlen lassen. Fügen Sie der Lösung drei Milliliter 5x FSME-Puffer, 2,25 Milliliter Acrylamid-Bis, 75 Mikroliter 10x Ammoniumpersulfat und 15 Mikroliter TEMED hinzu. Gießen Sie die Gellösung langsam in einem geneigten Winkel in den Gelkassettenhalter, um Luftblasen zu vermeiden.
Nach ca. 30 Minuten die Gelkassetten zerlegen und reinigen. Verwenden Sie die Mikro-TGGE-Apparatur mit einem Temperaturgradienten, der senkrecht zur Richtung der DNA-Migration eingestellt ist. Die oberen und unteren Elektrophorese-Pufferpads in zwei Millilitern 1x FSME-Puffer einweichen.
Legen Sie die Gelkassette in die horizontale Elektrophoresekammer und positionieren Sie die oberen und unteren Pufferpads. Laden Sie dann 10 Mikroliter des PCR-Produkts in die mittlere Vertiefung und einen Mikroliter des PCR-Produkts in jede Seitenvertiefung. Warten Sie eine Minute, schließen Sie das Netzteil an und versorgen Sie 100 Volt für 12 Minuten bei einem linearen Temperaturgradienten von 15 bis 65 Grad Celsius.
Nachdem der Lauf abgeschlossen ist. Nehmen Sie die Kassette heraus und entfernen Sie die obere Glasabdeckung. Gießen Sie 300 Mikroliter 10x SYBR Gold Fleck auf das Gel.
Visualisieren Sie die Schmelzprofile mit der blauen LED-Taschenlampe, die in dem handtellergroßen elektrophoretischen Gerät installiert ist. Wiederholen Sie jedes elektrophoretische Experiment dreimal, um die Reproduzierbarkeit der Daten zu bestätigen. Laden Sie die Micro-TGGE-Analysesoftware herunter und öffnen Sie sie.
Öffnen Sie die JPEG-Datei, die das Gelbild enthält. Klicken Sie auf die Schaltfläche "frame" und wählen Sie den entsprechenden Rahmen des Gelbildes aus. Klicken Sie auf die Schaltfläche "Koordinatenkorrektur" und fügen Sie zwei Referenzpunkte hinzu.
Klicken Sie auf die Schaltfläche "Feature-Punkte hinzufügen" und fügen Sie Beispielpunkte hinzu. Speichern Sie dann die verarbeiteten Gelbilddaten im Micro-TGGE-Format. Klicken Sie auf die Beispielschaltfläche und wählen Sie die Option "Suche nach einfachen Punkten", um zwei oder mehr Bilder zu vergleichen.
Für den C-to-U-RNA-Editiertyp zeigte die nicht bearbeitete Probe mit der ursprünglichen cBase ein längeres Schmelzmuster am Schmelzpunkt des Strangendes als die bearbeitete Probe mit der modifizierten U-Base. Für den A-zu-I-RNA-Editiertyp zeigte die bearbeitete Probe mit der modifizierten G-Base ein längeres Schmelzmuster am Schmelzpunkt am Strangende als die nicht bearbeitete Probe mit der ursprünglichen A-Base. Für den umgekehrten U-zu-C-RNA-Editiertyp zeigte die bearbeitete Probe im ersten Gen mit der modifizierten C-Base ein längeres Schmelzmuster zwischen den Anfangs- und Endschmelzpunkten des Strangs als die nicht bearbeitete Probe mit der ursprünglichen U-Base.
Ein ähnliches Muster wurde jedoch für das andere Gen nicht beobachtet. Die Musterähnlichkeitswerte der C-zu-U- und A-zu-I-RNA-Editing-Typen waren niedriger als die der beiden U-zu-C-RNA-Editing-Typen. Dieser Unterschied bezog sich wahrscheinlich auf die jeweiligen Standorte der Bearbeitungsseiten.
Die uMelt HETS-Analyse zeigte, dass die C-zu-U-Modifikation die Schmelzkurve entlang der Temperaturachse nach links verschieben würde. Die Musterähnlichkeitswerte, die aus Mikro-TGGE-Analysen der nicht bearbeiteten und der drei bearbeiteten Fragmente berechnet wurden, stimmten mit den mit uMelt vorhergesagten Ergebnissen überein. Die Optimierung des Zielgenfragments ist entscheidend für eine klare Unterscheidung zwischen dem editierten und dem nicht editierten Grund.
Und dieser Prozess wurde im aktuellen Protokoll vereinfacht.
