RNA 편집은 인간 질병에서 중요한 역할을합니다. 과학자는 의약품에 끝없는 적용을 찾고 있습니다. 이 프로토콜은 직접 RNA 시퀀싱의 필요 없이 RNA 편집에서 RNA 변형의 신속하고 신뢰할 수 있는 식별을 위한 비시퀀싱 접근법으로서 휴대용 온도 전기영동 기술의 적용을 입증한다.
마이크로 tTG 전기영동 기반 접근법은 네 개의 편집된 RNA 단편의 용융 프로파일과 이들의 상응하는 편집되지 않은 단편 사이의 차이를 특성화하기 위해 사용되었다. 패턴 유사성 점수는 방법의 재현성을 평가하기 위해 사용되었다. 이 플랫폼은 RNA에서 단일 기반 치환의 검출을 간단하고, 간단하고, 비용 효율적인 방식으로 가능하게 한다.
이 분석 도구는 Umelt HETS 웹 기반 도구를 사용하여 다른 용융 프로파일을 가진 유전자 단편을 식별하고 예측 된 용융 곡선을 생성함으로써 분자 생물학에서 새로운 발견을 도울 것으로 예상됩니다. 각 표적 유전자에 대해 300 내지 324개의 염기쌍 유전자 단편의 세 쌍을 설계한다. 추가 분석을 위해 헬리시티 축의 용융 영역 간의 최대 차이를 표시하는 편집되지 않은 쌍 또는 편집된 쌍을 선택합니다.
마이크로TGGE 분석을 위해, PCR 증폭에 의해 선택된 유전자 단편을 합성한다. DNA 다이나모 소프트웨어를 사용하여 정방향 및 역방향 프라이머를 설계하고, NCBI Primer-BLAST 도구를 사용하여 프라이머 서열을 검증한다. 표준 방법을 사용하여 편집 및 편집되지 않은 유전자의 소스에서 총 RNA를 추출합니다.
상응하는 cDNA를 합성하고, 20 마이크로리터의 PCR 반응 혼합물을 준비하고, 텍스트 원고에 기재된 바와 같이 PCR을 설정한다. 이어서, 6 마이크로리터의 PCR 생성물을 250 마이크로리터 튜브에 6x 겔 로딩 염료 3 마이크로리터와 혼합하고, 멸균수로 총 부피를 12 마이크로리터로 구성한다. PCR 산물을 추가 사용 시 사용할 때까지 섭씨 25도에 보관합니다.
겔 카세트를 조립하기 위해, 겔 중합을 위해 겔 카세트 홀더에 있는 다른 두 플레이트 사이에 상부 겔 플레이트를 샌드위치한다. 폴리 아크릴 아미드 겔을 준비하려면 7.2 그램의 요소를 50 밀리리터 튜브에 넣고 10 밀리리터의 멸균수에 녹입니다. 샘플을 20 내지 30초 동안 마이크로파로 가열한다.
그리고 실온으로 식히십시오. 3 밀리리터의 5x TBE 버퍼, 2.25 밀리리터의 아크릴 아미드 비스, 75 마이크로 리터의 10x 과황산암모늄 및 15 마이크로리터의 TEMED를 용액에 첨가하십시오. 기포를 피하기 위해 젤 용액을 젤 카세트 홀더에 천천히 기울이십시오.
약 30 분 후에 젤 카세트를 분해하고 청소하십시오. DNA 이동 방향에 수직인 온도 구배가 설정된 마이크로 TGGE 장치를 사용하십시오. 상부 및 하부 전기영동 버퍼 패드를 두 밀리리터의 1x TBE 버퍼에 담그십시오.
겔 카세트를 수평 전기영동 챔버 유닛에 위치시키고, 상부 및 하부 버퍼 패드를 위치시킨다. 그런 다음 10 마이크로리터의 PCR 산물을 중간 웰에 로딩하고, PCR 산물 1 마이크로리터를 양쪽 웰에 로딩한다. 잠시 기다렸다가 전원 장치를 연결하고 섭씨 15 ~ 65 도의 선형 온도 구배에서 12 분 동안 100 볼트를 공급하십시오.
실행이 완료된 후. 카세트를 꺼내 상단 유리 덮개를 제거하십시오. 300 마이크로 리터의 10x SYBR 골드 얼룩을 젤에 붓습니다.
손바닥 크기의 전기 영동 장치에 설치된 파란색 LED 손전등을 사용하여 용융 프로파일을 시각화합니다. 모든 전기영동 실험을 세 번 반복하여 데이터의 재현성을 확인합니다. 마이크로 TGGE 분석기 소프트웨어를 다운로드하여 엽니다.
젤 이미지가 포함된 JPEG 파일을 엽니다. 프레임"버튼을 클릭하고 젤 이미지의 적절한 프레임을 선택하십시오. 좌표 보정"버튼을 클릭하고 두 개의 참조 점을 추가하십시오.
특징점 추가"버튼을 클릭하고 샘플 포인트를 추가하십시오. 그런 다음 처리된 겔 이미지 데이터를 마이크로 TGGE 형식으로 저장합니다. 샘플 버튼을 클릭하고 간단한 포인트 검색"옵션을 선택하여 둘 이상의 이미지를 비교하십시오.
C-to-U RNA 편집 타입의 경우, 원래의 cBase를 갖는 편집되지 않은 샘플은, 변형된 U 염기를 갖는 편집된 샘플보다 가닥 말단 융점에서 더 긴 용융 패턴을 나타내었다. A-to-I RNA 편집 타입의 경우, 변형된 G 염기를 갖는 편집된 샘플은 원래의 A 염기를 갖는 편집되지 않은 샘플보다 가닥 말단 융점에서 더 긴 용융 패턴을 표시하였다. 역방향 U-to-C RNA 편집 유형의 경우, 변형된 C 염기를 갖는 첫 번째 유전자의 편집된 샘플은 원래의 U 염기를 갖는 편집되지 않은 샘플보다 가닥의 초기 및 말단 융점 사이에 더 긴 용융 패턴을 보였다.
그러나, 다른 유전자에 대해서도 유사한 패턴이 관찰되지 않았다. C-to-U 및 A-to-I RNA 편집 유형의 패턴 유사성 점수는 두 U-to-C RNA 편집 유형의 패턴 유사성 점수보다 낮았다. 이 차이는 편집 사이트의 각 위치와 관련이있을 가능성이 큽니다.
uMelt HETS 분석은 C-to-U 변형이 온도 축을 따라 용융 곡선을 왼쪽으로 이동시키는 것으로 나타났습니다. 편집되지 않은 세 단편과 편집된 세 단편의 마이크로 TGGE 분석으로부터 계산된 패턴 유사성 점수는 uMelt를 사용하여 예측된 결과와 일치하였다. 표적 유전자 단편의 최적화는 편집된 이유와 편집되지 않은 이유 사이의 명확한 분화를 위해 중요하다.
그리고이 프로세스는 현재 프로토콜에서 단순화되었습니다.
