L’édition de l’ARN joue un rôle essentiel dans les maladies humaines. Les scientifiques trouvent une application infinie dans les médicaments. Ce protocole démontre l’application de la technologie d’électrophorèse à température portable en tant qu’approche non séquentielle pour l’identification rapide et fiable de la modification de l’ARN dans l’édition de l’ARN sans avoir besoin d’un séquençage direct de l’ARN.
L’approche basée sur l’électrophorèse micro tTG a été utilisée pour caractériser les différences entre le profil de fusion de quatre fragments d’ARN modifiés et leurs fragments non édités correspondants. Les scores de similitude des modèles ont été utilisés pour évaluer la reproductibilité de la méthode. Cette plate-forme permet la détection de substitutions même à base unique dans les ARN, de manière directe, simple et rentable.
On s’attend à ce que cet outil d’analyse aide à de nouvelles découvertes en biologie moléculaire Commencez par identifier des fragments de gènes avec différents profils de fusion et générez des courbes de fusion prédites à l’aide de l’outil Web Umelt HETS. Concevoir trois paires de 300 à 324 fragments de gènes de paires de bases pour chaque gène cible. Sélectionnez la paire non modifiée ou modifiée qui affiche la différence maximale entre les régions de fusion sur l’axe d’hélicité pour une analyse plus approfondie.
Pour l’analyse micro-TGGE, synthétiser le fragment de gène sélectionné par amplification PCR. Concevez les amorces avant et arrière à l’aide du logiciel DNA dynamo et vérifiez la séquence d’amorce à l’aide de l’outil NCBI Primer-BLAST. Extraire l’ARN total de la source des gènes modifiés et non modifiés à l’aide de méthodes standard.
Synthétisez l’ADNc correspondant, préparez 20 microlitres du mélange réactionnel DE PCR et configurez la PCR comme décrit dans le manuscrit textuel. Ensuite, mélangez six microlitres du produit PCR avec trois microlitres de colorant à chargement de gel 6x dans un tube de 250 microlitres et composez le volume total à 12 microlitres avec de l’eau stérile. Conservez le produit PCR à 25 degrés Celsius jusqu’à ce qu’il soit utilisé ultérieurement.
Pour assembler les cassettes de gel, prenez en sandwich la plaque de gel supérieure entre les deux autres plaques du support de cassette de gel pour la polymérisation du gel. Pour préparer le gel de polyacrylamide, ajoutez 7,2 grammes d’urée dans un tube de 50 millilitres et dissolvez-les dans 10 millilitres d’eau stérile. Chauffer l’échantillon au micro-ondes pendant 20 à 30 secondes.
Et laissez-le refroidir à la température ambiante. Ajouter trois millilitres de 5x tampon TBE, 2,25 millilitres d’acrylamide bis, 75 microlitres de 10x persulfate d’ammonium et 15 microlitres de TEMED à la solution. Versez la solution de gel dans le support de cassette de gel lentement à un angle incliné pour éviter les bulles d’air.
Après environ 30 minutes, démontez les cassettes de gel et nettoyez-les. Utilisez l’appareil micro-TGGE avec un gradient de température défini perpendiculairement à la direction de la migration de l’ADN. Trempez les tampons tampons d’électrophorèse supérieurs et inférieurs dans deux millilitres de tampon TBE 1x.
Placez la cassette de gel dans l’unité de chambre d’électrophorèse horizontale et positionnez les tampons tampons supérieurs et inférieurs. Chargez ensuite 10 microlitres du produit PCR dans le puits central et un microlitre du produit PCR dans chaque puits latéral. Attendez une minute, connectez l’unité d’alimentation et alimentez 100 volts pendant 12 minutes à un gradient de température linéaire de 15 à 65 degrés Celsius.
Une fois l’exécution terminée. sortez la cassette et retirez le couvercle supérieur en verre. Versez 300 microlitres de 10x tache SYBR Gold sur le gel.
Visualisez les profils de fusion à l’aide de la lampe de poche LED bleue installée dans le dispositif électrophorétique de la taille d’une paume. Répétez chaque expérience électrophorétique trois fois pour confirmer la reproductibilité des données. Téléchargez et ouvrez le logiciel d’analyse micro-TGGE.
Ouvrez le fichier JPEG contenant l’image gel. Cliquez sur le bouton « cadre » et sélectionnez le cadre approprié de l’image gel. Cliquez sur le bouton de correction de coordonnées et ajoutez deux points de référence.
Cliquez sur le bouton « ajout de points de fonctionnalité » et ajoutez des points d’échantillonnage. Ensuite, enregistrez les données d’image de gel traitées au format micro-TGGE. Cliquez sur le bouton d’exemple et sélectionnez l’option de recherche de points simples pour comparer deux images ou plus.
Pour le type d’édition d’ARN C à U, l’échantillon non édité avec la cBase d’origine a montré un motif de fusion plus long au point de fusion final du brin que l’échantillon modifié avec la base U modifiée. Pour le type d’édition d’ARN de A à I, l’échantillon modifié avec la base G modifiée affichait un motif de fusion plus long au point de fusion de l’extrémité du brin que l’échantillon non modifié avec la base A d’origine. Pour le type d’édition d’ARN U-to-C inversé, l’échantillon modifié dans le premier gène avec la base C modifiée a montré un motif de fusion plus long entre les points de fusion initial et final du brin que l’échantillon non édité avec la base U d’origine.
Cependant, une tendance similaire n’a pas été observée pour l’autre gène. Les scores de similitude des modèles des types d’édition d’ARN C-to-you et A-to-I étaient inférieurs à ceux des deux types d’édition d’ARN U-to-C. Cette différence était probablement liée aux emplacements respectifs des sites d’édition.
L’analyse HETS uMelt a montré que la modification C-to-U déplacerait la courbe de fusion vers la gauche le long de l’axe de température. Les scores de similitude de modèle calculés à partir des analyses micro-TGGE des fragments non édités et des trois fragments édités étaient cohérents avec les résultats prédits à l’aide d’uMelt. L’optimisation du fragment de gène cible est essentielle pour une différenciation claire entre la raison modifiée et non éditée.
Et ce processus a été simplifié dans le protocole actuel.
