L'editing dell'RNA svolge un ruolo fondamentale nella malattia umana. Gli scienziati stanno trovando un'applicazione infinita nei farmaci. Questo protocollo dimostra l'applicazione della tecnologia di elettroforesi portatile della temperatura come approccio non sequenziale per l'identificazione rapida e affidabile della modifica dell'RNA nell'editing dell'RNA senza la necessità di sequenziamento diretto dell'RNA.
L'approccio basato sull'elettroforesi micro tTG è stato utilizzato per caratterizzare le differenze tra il profilo di fusione di quattro frammenti di RNA modificati e i loro corrispondenti frammenti non modificati. I punteggi di somiglianza del modello sono stati utilizzati per valutare la riproducibilità del metodo. Questa piattaforma consente il rilevamento anche di sostituzioni su base singola negli RNA, in modo diretto, semplice ed economico.
Si prevede che questo strumento analitico aiuterà nuove scoperte in biologia molecolare Begin identificando frammenti genici con diversi profili di fusione e genererà curve di fusione previste utilizzando lo strumento basato sul web Umelt HETS. Progettare tre coppie da 300 a 324 frammenti di geni di coppia di basi per ciascun gene bersaglio. Selezionate la coppia non modificata o modificata che mostra la differenza massima tra le regioni di fusione sull'asse dell'elicità per un'ulteriore analisi.
Per l'analisi micro-TGGE, sintetizzare il frammento di gene selezionato mediante amplificazione PCR. Progettare i primer avanti e indietro utilizzando il software DNA dynamo e verificare la sequenza di primer utilizzando lo strumento NCBI Primer-BLAST. Estrarre l'RNA totale dalla fonte di geni modificati e non modificati utilizzando metodi standard.
Sintetizzare il cDNA corrispondente, preparare 20 microlitri della miscela di reazione PCR e impostare la PCR come descritto nel manoscritto di testo. Quindi, mescolare sei microlitri del prodotto PCR con tre microlitri di colorante di carico gel 6x in un tubo da 250 microlitri e portare il volume totale a 12 microlitri con acqua sterile. Conservare il prodotto PCR a 25 gradi Celsius fino a nuovo utilizzo.
Per assemblare le cassette di gel, inserire la piastra di gel superiore tra le altre due piastre nel supporto della cassetta di gel per la polimerizzazione del gel. Per preparare il gel di poliacrilammide, aggiungere 7,2 grammi di urea a un tubo da 50 millilitri e sciogliere in 10 millilitri di acqua sterile. Riscaldare il campione in un forno a microonde per 20-30 secondi.
E lasciarlo raffreddare a temperatura ambiente. Aggiungere tre millilitri di tampone TBE 5x, 2,25 millilitri di acrilammide bis, 75 microlitri di 10x persolfato di ammonio e 15 microlitri di TEMED alla soluzione. Versare lentamente la soluzione di gel nel supporto della cassetta di gel con un angolo inclinato per evitare bolle d'aria.
Dopo circa 30 minuti, smontare le cassette di gel e pulirle. Utilizzare l'apparato micro-TGGE con un gradiente di temperatura impostato perpendicolarmente alla direzione della migrazione del DNA. Immergere i tamponi per elettroforesi superiore e inferiore in due millilitri di 1x tampone TBE.
Posizionare la cassetta di gel nell'unità della camera di elettroforesi orizzontale e posizionare i cuscinetti tampone superiore e inferiore. Quindi caricare 10 microlitri del prodotto PCR nel pozzetto centrale e un microlitro del prodotto PCR in ciascun pozzetto laterale. Attendere un minuto, collegare l'unità di alimentazione e fornire 100 volt per 12 minuti a un gradiente di temperatura lineare da 15 a 65 gradi Celsius.
Al termine dell'esecuzione. estrarre la cassetta e rimuovere il coperchio superiore in vetro. Versare 300 microlitri di 10x SYBR Gold macchia sul gel.
Visualizza i profili di fusione utilizzando la torcia a LED blu installata nel dispositivo elettroforetico delle dimensioni di un palmo. Ripeti tre volte ogni esperimento elettroforetico per confermare la riproducibilità dei dati. Scarica e apri il software dell'analizzatore micro-TGGE.
Aprire il file JPEG contenente l'immagine gel. Fare clic sul pulsante frame" e selezionare il frame appropriato dell'immagine gel. Fare clic sul pulsante "correzione coordinate" e aggiungere due punti di riferimento.
Fare clic sul pulsante "aggiunta di punti funzione" e aggiungere punti di esempio. Quindi, salvare i dati dell'immagine gel elaborati in formato micro-TGGE. Fare clic sul pulsante di esempio e selezionare l'opzione di ricerca di punti semplici per confrontare due o più immagini.
Per il tipo di modifica dell'RNA da C a U, il campione non modificato con la base c originale ha mostrato un modello di fusione più lungo al punto di fusione finale del filamento rispetto al campione modificato con la base U modificata. Per il tipo di modifica dell'RNA da A a I, il campione modificato con la base G modificata, ha mostrato un modello di fusione più lungo al punto di fusione dell'estremità del filamento rispetto al campione non modificato con la base A originale. Per il tipo di editing inverso dell'RNA da U a C, il campione modificato nel primo gene con la base C modificata ha mostrato un modello di fusione più lungo tra i punti di fusione iniziali e finali del filamento rispetto al campione non modificato con la base U originale.
Tuttavia, un modello simile non è stato osservato per l'altro gene. I punteggi di somiglianza del modello dei tipi di editing dell'RNA C-to-you e A-to-I erano inferiori a quelli dei due tipi di editing dell'RNA U-to-C. Questa differenza era probabilmente correlata alle rispettive posizioni dei siti di modifica.
L'analisi uMelt HETS ha mostrato che la modifica C-to-U sposterebbe la curva di fusione a sinistra lungo l'asse della temperatura. I punteggi di somiglianza del modello calcolati dalle analisi micro-TGGE dei frammenti non modificati e dei tre modificati erano coerenti con i risultati previsti utilizzando uMelt. L'ottimizzazione del frammento del gene bersaglio è fondamentale per una chiara differenziazione tra il motivo modificato e non modificato.
E questo processo è stato semplificato nel protocollo attuale.
