A edição de RNA tem um papel crítico na doença humana. Cientistas estão encontrando aplicação sem fim nos medicamentos. Este protocolo demonstra a aplicação da tecnologia de eletroforese de temperatura portátil como uma abordagem não sequenciamento para a identificação rápida e confiável da modificação do RNA na edição de RNA sem a necessidade de sequenciamento direto do RNA.
A abordagem baseada em micro tTG foi utilizada para caracterizar as diferenças entre o perfil de fusão de quatro fragmentos de RNA editados e seus fragmentos não editados correspondentes. Os escores de similaridade padrão foram utilizados para avaliar a reprodutibilidade do método. Esta plataforma permite a detecção de uma substituição única em RNAs, de forma simples, simples e econômica.
Espera-se que esta ferramenta analítica ajude a nova descoberta na biologia molecular Comece identificando fragmentos genéticos com diferentes perfis de fusão e gere curvas de fusão previstas usando a ferramenta baseada na web Umelt HETS. Projete três pares de 300 a 324 fragmentos genéticos de par de base para cada gene alvo. Selecione o par não editado ou editado que mostre a diferença máxima entre as regiões de fusão no eixo de helicidade para análise posterior.
Para análise micro-TGGE, sintetize o fragmento genético selecionado por amplificação PCR. Projete os primers dianteiros e invertidos usando o software de dínamo de DNA e verifique a sequência de primer usando a ferramenta NCBI Primer-BLAST. Extrair RNA total da fonte de genes editados e não editados usando métodos padrão.
Sintetizar o cDNA correspondente, preparar 20 microliters da mistura de reação PCR e configurar o PCR conforme descrito no manuscrito do texto. Em seguida, misture seis microliters do produto PCR com três microliters de corante de carregamento de gel 6x em um tubo de 250 microliteres, e compõe o volume total para 12 microliters com água estéril. Armazene o produto PCR a 25 graus Celsius até usar mais.
Para montar as fitas de gel, sanduiche a placa de gel superior entre as outras duas placas no porta-fitas de gel para polimerização de gel. Para preparar o gel de acrilamida poli, adicione 7,2 gramas de ureia a um tubo de 50 mililitros e dissolva em 10 mililitros de água estéril. Aqueça a amostra em um micro-ondas por 20 a 30 segundos.
E deixe esfriar até a temperatura ambiente. Adicione três mililitros de tampão 5x TBE, 2,25 mililitros de acrilamida bis, 75 microliters de persulfito de amônio de 10x e 15 microliters de TEMED à solução. Despeje a solução de gel no suporte de de gel lentamente em um ângulo inclinado para evitar bolhas de ar.
Após cerca de 30 minutos, desmonte as fitas de gel e limpe-as. Use o aparelho micro-TGGE com um conjunto de gradiente de temperatura perpendicular à direção da migração do DNA. Mergulhe as almofadas tampão de eletroforese superior e inferior em dois mililitros de tampão 1x TBE.
Coloque o de gel na unidade horizontal de câmara de eletroforese e posicione as almofadas tampão superior e inferior. Em seguida, carregue 10 microliters do produto PCR no meio bem, e um microliter do produto PCR em cada lado bem. Aguarde por um minuto, conecte a unidade de alimentação e forneça 100 volts por 12 minutos a um gradiente linear de temperatura de 15 a 65 graus Celsius.
Depois que a corrida tiver sido concluída. tirar o e remover a tampa superior do vidro. Despeje 300 microliters de 10x mancha de ouro SYBR no gel.
Visualize os perfis de fusão usando a lanterna LED azul instalada no dispositivo eletroforético do tamanho da palma da mão. Repita todos os experimentos eletroforéticos três vezes para confirmar a reprodutibilidade dos dados. Baixe e abra o software do analisador micro-TGGE.
Abra o arquivo JPEG contendo a imagem em gel. Clique no botão "frame" e selecione o quadro apropriado da imagem em gel. Clique no botão de correção da coordenada e adicione dois pontos de referência.
Clique na adição do botão "pontos de recurso" e adicione pontos de amostra. Em seguida, salve os dados de imagem de gel processados no formato micro-TGGE. Clique no botão de amostra e selecione a opção busca por pontos simples para comparar duas ou mais imagens.
Para o tipo de edição de RNA C-to-U, a amostra não editada com o cBase original, mostrou um padrão de fusão mais longo no ponto de fusão da extremidade do fio do que a amostra editada com a base U modificada. Para o tipo de edição de RNA A-to-I, a amostra editada com a base G modificada, exibiu um padrão de fusão mais longo no ponto de fusão da extremidade do fio do que a amostra não editada com a base A original. Para o tipo inverso de edição de RNA U-to-C, a amostra editada no primeiro gene com a base C modificada mostrou um padrão de fusão mais longo entre os pontos de fusão inicial e final da cadeia do que a amostra não editada com a base U original.
No entanto, um padrão semelhante não foi observado para o outro gene. As pontuações de similaridade padrão dos tipos de edição de RNA C-to-You e A-to-I foram inferiores às dos dois tipos de edição de RNA U-to-C. Essa diferença provavelmente estava relacionada aos respectivos locais dos sites de edição.
A análise do uMelt HETS mostrou que a modificação C-to-U mudaria a curva de fusão para a esquerda ao longo do eixo de temperatura. Os escores de similaridade de padrão calculados a partir de análises micro-TGGE dos não editados e dos três fragmentos editados foram consistentes com os resultados previstos usando o uMelt. A otimização do fragmento genético alvo é fundamental para uma clara diferenciação entre a razão editada e não editada.
E esse processo foi simplificado no protocolo atual.
