Редактирование РНК играет решающую роль в заболевании человека. Ученые находят бесконечное применение в лекарствах. Этот протокол демонстрирует применение технологии переносного температурного электрофореза в качестве несеквенирующего подхода для быстрой и надежной идентификации модификации РНК при редактировании РНК без необходимости прямого секвенирования РНК.
Для характеристики различий между профилем плавления четырех отредактированных фрагментов РНК и их соответствующими неотредактированными фрагментами использовался подход на основе электрофореза tTG. Оценки сходства паттернов использовались для оценки воспроизводимости метода. Эта платформа позволяет обнаруживать даже одиночную замену в РНК простым, простым и экономически эффективным способом.
Ожидается, что этот аналитический инструмент поможет новым открытиям в молекулярной биологии Начать с идентификации фрагментов генов с различными профилями плавления и генерировать прогнозируемые кривые плавления с использованием веб-инструмента Umelt HETS. Разработайте три пары от 300 до 324 фрагментов гена пары оснований для каждого гена-мишени. Для дальнейшего анализа выберите неотредактированную или отредактированную пару, показывающую максимальную разницу между областями плавления на оси спиральности.
Для микро-TGGE анализа синтезируют выбранный фрагмент гена методом ПЦР-амплификации. Спроектируйте прямые и обратные праймеры с помощью программного обеспечения ДИНАМО ДНК и проверьте последовательность праймеров с помощью инструмента NCBI Primer-BLAST. Извлекайте общую РНК из источника отредактированных и нередактированных генов с помощью стандартных методов.
Синтезируют соответствующую кДНК, готовят 20 микролитров реакционной смеси ПЦР и настраивают ПЦР, как описано в тексте рукописи. Затем смешайте шесть микролитров продукта ПЦР с тремя микролитрами 6-кратного гелевого нагружающего красителя в трубке объемом 250 микролитров и составьте общий объем до 12 микролитров стерильной водой. Хранить препарат ПЦР при температуре 25 градусов Цельсия до дальнейшего использования.
Чтобы собрать гелевые кассеты, поместите верхнюю гелевую пластину между двумя другими пластинами в держатель для гелевой кассеты для полимеризации геля. Для приготовления полиакриламидного геля добавьте 7,2 грамма мочевины в 50-миллилитровый тюбик и растворите в 10 миллилитрах стерильной воды. Нагрейте образец в микроволновой печи в течение 20-30 секунд.
И дайте остыть до комнатной температуры. Добавьте в раствор три миллилитра 5x TBE буфера, 2,25 миллилитра акриламида биса, 75 микролитров 10x персульфата аммония и 15 микролитров TEMED. Медленно налейте раствор геля в держатель для гелевых кассет под наклоном, чтобы избежать пузырьков воздуха.
Примерно через 30 минут разберите гелевые кассеты и очистите их. Используют аппарат micro-TGGE с установленным градиентом температуры перпендикулярно направлению миграции ДНК. Замочите верхнюю и нижнюю буферные прокладки электрофореза в двух миллилитрах буфера 1x TBE.
Поместите гелевую кассету в горизонтальный блок камеры электрофореза и расположите верхнюю и нижнюю буферные прокладки. Затем загрузите 10 микролитров продукта ПЦР в среднюю лунку и по одному микролитру продукта ПЦР в каждую боковую скважину. Подождите минуту, подключите блок питания и подайте 100 вольт в течение 12 минут при линейном температурном градиенте от 15 до 65 градусов Цельсия.
После завершения запуска. достаньте кассету и снимите верхнюю стеклянную крышку. Налейте на гель 300 микролитров 10-кратного пятна SYBR Gold.
Визуализируйте плавильные профили с помощью синего светодиодного фонарика, установленного в электрофоретическом устройстве размером с ладонь. Повторяйте каждый электрофоретический эксперимент трижды, чтобы подтвердить воспроизводимость данных. Загрузите и откройте программное обеспечение анализатора micro-TGGE.
Откройте файл JPEG, содержащий изображение геля. Нажмите на кнопку «рамка» и выберите подходящую рамку гелевого изображения. Нажмите на кнопку «Коррекция координат» и добавьте две контрольные точки.
Нажмите на кнопку добавления точек функции и добавьте точки выборки. Затем сохраните обработанные данные изображения геля в формате micro-TGGE. Нажмите на кнопку примера и выберите опцию поиска простых точек, чтобы сравнить два или более изображений.
Для типа редактирования C-to-U РНК неотредактированный образец с исходной cBase показал более длинную картину плавления в конце цепи, чем отредактированный образец с модифицированным основанием U. Для типа редактирования РНК от А до I отредактированный образец с модифицированным основанием G отображал более длинную картину плавления в точке плавления на конце нити, чем неотредактированный образец с исходным основанием A. Для обратного типа редактирования РНК U-to-C отредактированный образец в первом гене с модифицированным основанием C показал более длинную картину плавления между начальной и конечной точками плавления нити, чем неотредактированный образец с исходным основанием U.
Однако аналогичная картина не наблюдалась для другого гена. Показатели сходства паттернов типов редактирования РНК C-to-you и A-to-I были ниже, чем у двух типов редактирования РНК U-to-C. Эта разница, вероятно, была связана с соответствующими местоположениями сайтов редактирования.
Анализ uMelt HETS показал, что модификация C-to-U сместит кривую плавления влево вдоль оси температуры. Оценки сходства паттернов, рассчитанные на основе анализа микро-TGGE неотредактированных и трех отредактированных фрагментов, соответствовали результатам, предсказанным с использованием uMelt. Оптимизация фрагмента гена-мишени имеет решающее значение для четкого разграничения отредактированной и нередактированной причины.
И этот процесс был упрощен в текущем протоколе.
