RNA編集は、ヒトの疾患において重要な役割を果たしている。科学者は薬に無限の応用を見つけています。このプロトコルは、直接RNAシーケンシングを必要とせずにRNA編集におけるRNA修飾を迅速かつ確実に同定するための非シーケンシングアプローチとしてのポータブル温度電気泳動技術の適用を実証しています。
マイクロtTG電気泳動ベースのアプローチを使用して、4つの編集されたRNA断片の融解プロファイルとそれらに対応する非編集断片の違いを特徴付けました。パターン類似性スコアは、本方法の再現性を評価するために使用した。このプラットフォームにより、RNA中の単一ベースの置換も、簡単でシンプルで費用対効果の高い方法で検出できます。
この分析ツールは、分子生物学における新しい発見に役立つことが期待されています まず、異なる融解プロファイルを持つ遺伝子断片を同定し、Umelt HETSウェブベースのツールを使用して予測融解曲線を生成します。各標的遺伝子について300~324塩基対の遺伝子断片の3対を設計する。ヘリシティ軸上の融解領域間の最大差を示す非編集または編集済みのペアを選択して、さらに解析します。
マイクロTGGE解析の場合、PCR増幅により選択した遺伝子断片を合成する。DNAダイナモソフトウェアを用いてフォワードプライマーおよびリバースプライマーを設計し、NCBI Primer-BLASTツールを使用してプライマー配列を検証した。標準的な方法を用いて、編集済みおよび非編集された遺伝子の供給源から全RNAを抽出する。
対応するcDNAを合成し、20マイクロリットルのPCR反応混合物を調製し、テキスト原稿に記載されているようにPCRをセットアップする。次に、6マイクロリットルのPCR産物と3マイクロリットルの6倍ゲルローディング色素を250マイクロリットルのチューブで混合し、滅菌水で総容量を12マイクロリットルにします。PCR産物を、さらに使用するまで摂氏25度で保存してください。
ゲルカセットを組み立てるには、上部ゲルプレートをゲル重合用のゲルカセットホルダー内の他の2つのプレートの間に挟み込む。ポリアクリルアミドゲルを調製するには、50ミリリットルのチューブに7.2グラムの尿素を加え、10ミリリットルの滅菌水に溶解する。試料をマイクロ波で20~30秒間加熱する。
そして室温まで冷まします。3ミリリットルの5x TBE緩衝液、2.25ミリリットルのアクリルアミドビス、75マイクロリットルの10x過硫酸アンモニウム、および15マイクロリットルのTEMEDを溶液に加える。気泡を避けるために、ゲル溶液をゲルカセットホルダーに傾斜した角度でゆっくりと注ぎます。
約30分後、ゲルカセットを分解して清掃します。DNA遊走の方向に対して垂直に設定された温度勾配を有するマイクロTGGE装置を使用する。上下の電気泳動バッファーパッドを2ミリリットルの1x TBEバッファーに浸します。
ゲルカセットを水平電気泳動チャンバーユニット内に置き、上下のバッファーパッドを配置した。次いで、10マイクロリットルのPCR産物を中央ウェルに、および1マイクロリットルのPCR産物を各側ウェルにロードする。1分間待ってからパワーユニットを接続し、15~65°Cの直線温度勾配で100ボルトを12分間供給します。
実行が完了した後。カセットを取り出し、上部のガラスカバーを取り外します。300マイクロリットルの10x SYBRゴールドステインをゲルに注ぎます。
手のひらサイズの電気泳動装置に取り付けられた青色LED懐中電灯を使用して、溶融プロファイルを視覚化します。すべての電気泳動実験を3回繰り返して、データの再現性を確認します。マイクロTGGE分析装置ソフトウェアをダウンロードして開きます。
ゲル画像を含むJPEGファイルを開きます。フレーム」ボタンをクリックし、ゲル画像の適切なフレームを選択します。座標補正」ボタンをクリックし、2つの基準点を追加します。
「特徴点の追加」ボタンをクリックし、サンプル点を追加します。そして、処理したゲル画像データをマイクロTGGE形式で保存する。サンプルボタンをクリックし、単純なポイントの検索"オプションを選択して、2つ以上の画像を比較します。
C-to-U RNA編集タイプの場合、元のcBaseを有する非編集サンプルは、修飾U塩基を有する編集サンプルよりも鎖末端融点においてより長い融解パターンを示した。A-to-I RNA編集タイプの場合、修飾G塩基を有する編集サンプルは、元のA塩基を有する非編集サンプルよりも鎖末端融点において長い融解パターンを示した。逆U-to-C RNA編集タイプの場合、修飾C塩基を有する第1遺伝子において編集されたサンプルは、元のU塩基を有する非編集サンプルよりも鎖の初期融点と末端融点との間のより長い融解パターンを示した。
しかし、他の遺伝子についても同様のパターンは認められなかった。C-to-UおよびA-to-I RNA編集タイプのパターン類似性スコアは、2つのU-to-C RNA編集タイプのパターン類似性スコアよりも低かった。この違いは、編集サイトのそれぞれの場所に関連している可能性があります。
uMelt HETS解析では、C-to-U修正が温度軸に沿って融解曲線を左にシフトすることを示しました。非編集断片および3つの編集断片のマイクロTGGE分析から計算されたパターン類似性スコアは、uMeltを用いて予測された結果と一致した。標的遺伝子断片の最適化は、編集された理由と編集されていない理由との間の明確な区別のために重要である。
そして、このプロセスは現在のプロトコルで簡素化されています。
