Este protocolo permite uma visualização de estruturas tridimensionais em rim completo, o que pode levar a descobertas inovadoras na pesquisa renal, fornecendo uma perspectiva macroscópica. A coloração de órgãos de montagem inteira é um desafio devido à dificuldade de penetração de anticorpos. Este protocolo demonstrou a coloração de alta qualidade e montagem completa dos rins pelos anticorpos.
Para começar, realizar a fixação da imersão imediatamente após a fixação da perfusão e amostragem renal, imergindo o rim em paraformaldeído a 4% a quatro graus Celsius por 16 horas. Dê três lavagens usando PBS por duas horas cada. Realizar o processo de descoloração e deslipidação imergindo o rim fixo em sete milímetros de 50%CUBIC-L em um tubo de fundo redondo de 14 mililitros, com agitação suave à temperatura ambiente.
Após seis horas, mergulhe o rim em sete mililitros de CUBIC-L em um tubo de fundo redondo de 14 milímetros, com agitação suave a 37 graus Celsius por cinco dias. Atualize CUBIC-L todos os dias. Uma vez que a descoloração e a deslipidação estejam completas, use uma colher de dosagem para o manuseio da amostra e lave o rim três vezes com PBS à temperatura ambiente por duas horas.
Imunocorante do rim deslipidado em anticorpos primários diluídos em solução tampão de coloração, com agitação suave em um agitador de incubadora a 37 graus Celsius por sete dias. Em seguida, lave o rim com 0,5%Triton X-100 em PBS, também conhecido como PBST, à temperatura ambiente por um dia. Para a coloração de anticorpos secundários, trate o rim com anticorpos secundários no tampão de coloração, no escuro, com agitação suave a 37 graus Celsius por sete dias.
Fixe a coloração com uma lavagem PBST à temperatura ambiente durante um dia. Após a fixação, mergulhe o rim em formaldeído a 1% em PB por três horas e lave-o com PBS à temperatura ambiente por seis horas. Realizar a correspondência do índice de refração imergindo o rim em sete mililitros de 50%CUBIC-R+em um tubo de fundo redondo de 14 mililitros com agitação por um dia, seguido de tratamento com sete mililitros de CUBIC-R+com agitação à temperatura ambiente por dois dias.
Com a ajuda do método de coloração imunológica, nervos e artérias simpáticas em um rim inteiro foram visualizados em imagens renais 3D. Além disso, nervos simpáticos renais anormais foram visualizados após lesão de isquemia-reperfusão. Este protocolo também facilitou a visualização dos nervos simpáticos em todo o baço.
O processo de quantificação dos dados para a coloração imunofluorescente tridimensional é apresentado aqui. Além disso, os ductos coletores, o segmento S1 dos túbulos proximais e os glomérulos foram visualizados com sucesso em todo um rim. A glomerulomegalia suprimida, resultante da administração de medicamentos nos estágios iniciais da doença renal diabética, também foi visualizada em imagens 3D.
Este protocolo pode rotular a molécula específica dentro de um rim inteiro. Assim, os pesquisadores podem analisar a alteração da estrutura na vasculatura ou encontrar eventos raros nos tecidos renais.
