Colorazione tridimensionale a rene intero con CUBIC

Questo protocollo consente una visualizzazione di strutture tridimensionali in rene pieno, che può portare a scoperte innovative nella ricerca renale fornendo una prospettiva macroscopica. La colorazione dell'intero organo è difficile a causa della difficoltà nella penetrazione degli anticorpi. Questo protocollo ha dimostrato l'alta qualità, colorazione a montaggio intero dei reni da parte degli anticorpi.

Per iniziare, eseguire la fissazione per immersione immediatamente dopo la fissazione della perfusione e il prelievo del rene, immergendo il rene in paraformaldeide al 4% a quattro gradi Celsius per 16 ore. Dare tre lavaggi usando PBS per due ore ciascuno. Eseguire il processo di decolorazione e delipidazione immergendo il rene fisso in sette millimetri di 50%CUBIC-L in un tubo a fondo tondo da 14 millilitri, con agitazione delicata a temperatura ambiente.

Dopo sei ore, immergere il rene in sette millilitri di CUBIC-L in un tubo a fondo rotondo da 14 millimetri, con un leggero scuotimento a 37 gradi Celsius per cinque giorni. Aggiornare CUBIC-L ogni giorno. Una volta completata la decolorazione e la delipidazione, utilizzare un cucchiaio dosatore per la manipolazione del campione e lavare il rene tre volte con PBS a temperatura ambiente per due ore.

Colorare il rene delipidizzato in anticorpi primari diluiti in soluzione tampone colorante, con leggero scuotimento in uno shaker incubatore a 37 gradi Celsius per sette giorni. Quindi, lavare il rene con 0,5% Triton X-100 in PBS, noto anche come PBST, a temperatura ambiente per un giorno. Per la colorazione degli anticorpi secondari, trattare il rene con anticorpi secondari nel tampone di colorazione, al buio, con un leggero scuotimento a 37 gradi Celsius per sette giorni.

Fissare la colorazione con un lavaggio PBST a temperatura ambiente per un giorno. Dopo la fissazione, immergere il rene in formaldeide all'1% in PB per tre ore e lavarlo con PBS a temperatura ambiente per sei ore. Eseguire la corrispondenza dell'indice di rifrazione immergendo il rene in sette millilitri di 50% CUBIC-R+in un tubo a fondo tondo da 14 millilitri agitando per un giorno, seguito da un trattamento con sette millilitri di CUBIC-R+ agitando a temperatura ambiente per due giorni.

Con l'aiuto del metodo di colorazione immunitaria, i nervi simpatici e le arterie in un rene intero sono stati visualizzati nell'imaging renale 3D. Inoltre, i nervi simpatici renali anormali sono stati visualizzati dopo danno da ischemia-riperfusione. Questo protocollo ha anche facilitato la visualizzazione dei nervi simpatici in tutta la milza.

Il processo di quantificazione dei dati per la colorazione immunofluorescente tridimensionale è visualizzato qui. Inoltre, i dotti di raccolta, il segmento S1 dei tubuli prossimali e i glomeruli sono stati visualizzati con successo in un intero rene. La glomerulomegalia soppressa, derivante dalla somministrazione di farmaci nelle prime fasi della malattia renale diabetica, è stata visualizzata anche nell'imaging 3D.

Questo protocollo può etichettare la molecola specifica all'interno di un intero rene. Pertanto, i ricercatori possono analizzare l'alterazione della struttura nel sistema vascolare o trovare eventi rari nei tessuti renali.