体内 啮齿动物膨胀诱发尿路上皮ATP释放的管腔测量

我们的协议测量ATP，这是膀胱中的重要递质，这将使我们能够进一步询问控制其释放的机制。我们的技术直接从膀胱腔测量ATP，使其比使用培养细胞或膀胱组织的技术更具生理相关性。演示该程序的将是我实验室的研究技术人员Keara Healy和Stephanie Daugherty。

首先，通过将动物置于用4%至5%异氟醚在氧气中气体的封闭盒中来诱导初始麻醉。皮下注射双侧聚氨酯，然后将动物放在笼子中，让聚氨酯生效近两个小时。等待聚氨酯生效后，用镊子捏住动物的脚来测试适当的麻醉平面。

为了防止在实验过程中膀胱因膨胀而收缩，向动物注射神经节阻断剂六甲铵。接下来，将眼药膏涂抹在动物的眼睛上，以防止在实验过程中干燥。现在剃掉动物的腹部并进行中线剖腹手术以暴露膀胱。

使用火焰，燃烧短长度PE50内医用管的一端，将22号针放入管的另一端，并填充克雷布斯溶液。在膀胱圆顶上放置一小圈 3-0 丝缝，并进行小膀胱造口术以插入导管的喇叭形端。在用一只手握住导管的同时，用另一只手拧紧缝合环以将导管固定到位。

通过在缝合线上打两个结来完成导管固定。向后拉导管，直到喇叭头与膀胱壁接触。通过导管注入少量克雷布斯溶液来测试设置的泄漏。

将静脉导管的末端浸入手术润滑剂中。用一对镊子轻轻握住尿道外道口，并将导管尖端沿尾部方向插入尿道口，如手稿中所述。将导管旋转 90 度并轻轻前进。

插入导管，直到鲁尔锁毂距离尿道外开口远端 5 毫米。固定导管并防止导管周围泄漏，方法是在尿道外道口周围缠绕一小段 3-0 丝线并将其紧紧绑住。用胶带将导管固定在尾部，以防止其意外拉出。

导尿后，通过耻骨上膀胱导管轻轻将克雷布斯溶液注入膀胱，并确认液体从尿道导管流出而不是在其周围。使用3-0丝线关闭膀胱上的腹部切口。将吸收垫放在加热垫上，以保持身体热量并吸收液体。

将动物固定在倾斜板上，以帮助通过尿道导管排出膀胱内液体，然后打开加热垫。将耻骨上导管连接到三向止动旋塞，将导管连接到注射泵和压力传感器。通过放大器和数据采集系统将压力传感器连接到计算机。

以每分钟 0.1 毫升的速度通过耻骨上导管输注 Krebs 溶液，并让液体通过尿道导管排出一小时，以洗掉导管植入期间释放的任何残留 ATP。在此冲洗期之后，使用鲁尔锁塞盖住尿道导管。测量膀胱中的压力，并寻找膀胱内压力缓慢上升至30厘米水的压力，而压力没有急剧增加，表明膀胱收缩。

当压力达到30厘米水时，从尿道导管上取下塞子，以防止对膀胱造成损害。输注膀胱并从尿道导管中收集淋洗液。立即测试100微升等分试样的淋洗液的ATP或冷冻以进行以后的批量定量。

为了测试膀胱扩张对管腔ATP浓度的影响，用塞子盖住尿道导管并监测膀胱压力，直到达到所需水平，然后打开尿道导管盖并收集淋洗液进行ATP测量或冷冻，如上所述。每次膨胀后，让膀胱休息并冲洗 10 到 15 分钟，然后再采集额外的样本。为了测试药物对ATP释放的影响，请将输注膀胱的克雷布斯溶液切换到含有所选药物的克雷布斯。

如前所述，灌注药物10至15分钟以产生效果，然后从未膨胀和扩张的膀胱中收集样本。将100微升灌注液样品与50微升测定混合物放入光度计中以供读取。要从相对光单位转换为ATP浓度，请在克雷布斯溶液中以10倍稀释液连续稀释ATP，范围从1微摩尔到10皮摩尔，以创建标准曲线，并在光度计中读取它们。

将结果读数绘制在图表上，并执行非线性回归以推断从动物身上采集的样品中的浓度。当尿道导管堵塞时，将溶液输注到膀胱中会导致膀胱内压力随着膀胱收缩而急剧上升。六甲铵给药后，观察到膀胱内压力更缓慢地升高，允许压力上升至30厘米的水而不会收缩。

亮蓝色FCF显著降低了标准曲线的斜率，足以改变样品中ATP浓度的计算值。使用含有亮蓝色FCF的克雷布斯标准品计算样品中ATP的浓度可能导致ATP浓度被低估50% 膀胱膨胀会增加管腔ATP浓度，在NTPDase apvrase存在下可能会降低，或者在ARL67156抑制内源性NTPD ACE时升高。分析了牵拉诱导的尿路上皮ATP释放。

膨胀诱发的ATP释放被潘克丁通道拮抗剂，亮蓝色FCF和碳氧松阻断，但不能被连接子通道拮抗剂18α-甘草次酸阻断。必须使用适当的标准曲线将所有光度计读数转换为ATP浓度，因为路西法荧光素酶反应极易受到多种不同试剂的干扰。我们的技术可用于研究膀胱腔内任何分子的膨胀诱发释放，假设存在该分子的合适测定。