免疫组化检测异常朊蛋白

该技术允许通过组织中的PrP搔痒症技术对朊病毒病进行确认性诊断，分析PrP搔痒症的类型和分布，以评估与已知PrP搔痒症沉积曲线的惩罚性偏差。该技术是标准化的，并使用针对PrP搔痒症的特异性抗体，使PrP搔痒症在组织中的沉积可视化。该技术还提供有关神经解剖区域和细胞类型的信息。

首先将带有组织切片的载玻片放入不锈钢染色篮中。将篮子放入二甲苯浴中。三分钟后，取出篮子并再次浸入。

要去除二甲苯并使切片再水化，请将篮子浸入无水乙醇浴中。三分钟后，取出篮子并再次浸入。风干切片，然后将其放入90%乙醇浴中一分钟。

接下来，将该部分转移到70%乙醇浴中再发酵一分钟。对于每次乙醇浴处理，轻轻搅拌载玻片篮两次，并在下一次转移之前排干篮子。将篮子转移到50%乙醇浴中一分钟。

在室温下小心地将组织切片浸入98%甲酸中30分钟。用自来水冲洗切片五分钟，然后在蒸馏水中冲洗两次。在装有500毫升蒸馏水的压力室中使用不锈钢染色容器，在98摄氏度下预处理10毫摩尔柠檬酸盐缓冲液20分钟。

出于质量控制目的，在篮子上放置一段粘性高压釜指示胶带以监测温度和压力。一旦警报表明设备已达到编程时间和温度，请用载玻片浸入篮子。接下来，在压力室上启动程序以设定点 2 并记录该程序的初始和最终压力。

对于内源性过氧化物酶的灭活，将装有样品部分的载玻片篮浸入3%过氧化氢甲醇浴中30分钟。在流水下桥接部分五分钟 排水后，将部分浸入Tris缓冲盐水中再浸泡五分钟。对于免疫检测，将每张载玻片放在市售的盖板支架上，该支架预先用Tris缓冲盐水润湿，组织侧朝向支架，载玻片边缘与支架的两个下点重合。

确保避免气泡。将滑动支架组件夹在拇指和食指之间。将一根手指放在样品载玻片的顶部，另一根手指放在支架的底部，然后将组件放在系统的库中。

为确保套件组装良好，请用Tris缓冲盐水填充样品载玻片和支架之间的孔，不要溢出。从这一点开始，确保在支架和载玻片之间必须保留大约 80 微升的 Tris 缓冲盐水。不要让切片干燥。

通过在Tris缓冲盐水中将载玻片样品与二抗宿主相同物种的20%正常血清预孵育30分钟，减少一抗处理前的背景染色。在不清洗切片的情况下，将200微升一抗溶液直接涂入载玻片支架组的每个孔中，并在室温下孵育60分钟。要清洗切片，请用Tris缓冲盐水填充孔，然后等待五分钟。

重复洗涤两次。接下来，用 10% 马血清在 Tris 缓冲盐水中以 1 至 200 浓度稀释生物素化的二抗。根据要处理的部分数量修复所需的体积。

将200微升二抗溶液应用于载玻片支架组的每个孔中。在室温下孵育30分钟后，重复Tris缓冲盐水洗涤。为了与亲和素 - 生物素复合物过氧化物酶孵育，在使用前30分钟准备试剂，并在滑板支架的每个孔中施用200微升溶液。

完成后，将板架在室温下孵育30分钟。测定已知传染性海绵状脑病阴性对照动物的非特异性免疫标记水平，以正确解释特异性异常朊蛋白免疫标记。注意到抗PrP抗体的非靶标标记表现为离散的神经元内细颗粒染色，神经枕中不规则的细线染色，某些灰质和白质区域的弥漫性非颗粒标记以及神经元的弥漫性细胞质标记。

该表总结了在牛海绵状脑病、经典和非典型搔痒症以及宫颈慢性消耗性疾病中观察到的免疫标记异常朊蛋白类型的描述，以做出阳性诊断，并建立了阴性、不确定和不合适结果的标准。所有步骤都非常重要。溶液的pH值和室温是该技术成功的重要特征。

开发免疫组织化学来检测PrP搔痒症和细胞类型可以提供有关参与主要发病机制的每个细胞的信息。