この技術は、組織中のPrPスクレイピーの技術によるプリオン病の確認診断を可能にし、既知のPrPスクレイピー沈着プロファイルに対する懲罰的偏差を評価するためにPrPスクレイピーの種類および分布を分析する。この技術は標準化されており、PrPスクレイピーに対する特異的抗体を使用しており、組織におけるPrPスクレイピー沈着の可視化を可能にします。この技術はまた、神経解剖学的領域および細胞の種類に関する情報を提供する。
まず、組織切片を含むスライドをステンレス鋼の染色バスケットに入れます。バスケットをキシレン浴に入れます。3分後、バスケットを取り外してもう一度浸します。
キシレンを除去して切片を再水和するには、バスケットを絶対エタノール浴に浸します。3分後、バスケットを取り外してもう一度浸します。切片を風乾してから、90%エタノール浴に1分間入れます。
次に、切片を70%エタノール浴にさらに1分間移します。エタノール浴処理ごとに、スライドバスケットを2回静かに攪拌し、次の移送の前にバスケットを排出します。バスケットを50%エタノールバスに1分間移します。
組織切片を室温で98%ギ酸に30分間注意深く浸します。切片を水道水で5分間すすぎ、蒸留水で2回すすぎます。500ミリリットルの蒸留水で満たされた圧力チャンバー内のステンレス鋼染色容器を使用して、10ミリモルのクエン酸塩バッファーを摂氏98度で20分間前処理します。
品質管理の目的で、バスケットに粘着性オートクレーブインジケータテープのセクションを置き、温度と圧力を監視します。機器がプログラムの時間と温度に達したことをアラームが示したら、バスケットをスライドに浸します。次に、圧力室でプログラムを開始してセットポイント2にし、このプログラムの初期圧力と最終圧力を記録します。
内因性ペルオキシダーゼを不活性化するには、サンプル切片を含むスライドバスケットをメタノール中の3%過酸化水素浴に30分間浸します。切片を流水で5分間橋渡しします 排水後、切片をトリス緩衝生理食塩水にさらに5分間浸します。免疫検出のために、各スライドをトリス緩衝生理食塩水であらかじめ湿らせた市販のカバープレートホルダーに置き、組織側をホルダーに向け、スライドの端をホルダーの2つの下部ポイントと一致します。
気泡を避けてください。スライドホルダーアセンブリを親指と人差し指で挟みます。片方の指をサンプルスライドの上に置き、もう片方の指をホルダーの下部に置き、アセンブリをシステムのギャラリーに置きます。
セットが適切に組み立てられていることを確認するために、サンプルスライドとホルダーの間のウェルに、トリス緩衝生理食塩水をオーバーフローせずに充填します。この時点から、約80マイクロリットルのトリス緩衝生理食塩水をホルダーとスライドの間に保持する必要があることを確認してください。切片を乾かさないでください。
トリス緩衝生理食塩水中で二次抗体宿主と同じ種の20%正常血清でスライドサンプルを30分間プレインキュベートすることにより、一次抗体で処理する前にバックグラウンド染色を減らします。切片を洗浄せずに、200マイクロリットルの一次抗体溶液をスライドホルダーセットの各ウェルに直接塗布し、室温で60分間インキュベートします。切片を洗浄するには、ウェルにトリス緩衝生理食塩水を満たし、5分間待ちます。
洗浄を2回繰り返します。次に、ビオチン化二次抗体をトリス緩衝生理食塩水中で1〜200濃度で10%ウマ血清で希釈します。治療するセクションの数に応じて必要な量を修復します。
200マイクロリットルの二次抗体溶液をスライドホルダーセットの各ウェルに塗布します。室温で30分間インキュベートした後、トリス緩衝生理食塩水洗浄を繰り返す。アビジン-ビオチン複合体ペルオキシダーゼとのインキュベーションのために、使用の30分前に試薬を調製し、スライドプレートホルダーの各ウェルに200マイクロリットルの溶液を塗布する。
完了したら、プレートホルダーセットを室温で30分間インキュベートします。既知の伝染性海綿状脳症陰性対照動物における非特異的免疫標識のレベルは、特異的異常プリオンタンパク質免疫標識を適切に解釈するために決定された。抗PrP抗体による非標的標識は、離散的なニューロン内微粒子染色、ニューロパイルの不規則な微細な線状染色糸、一部の灰白質および白質領域におけるびまん性非粒子標識、およびニューロンのびまん性細胞質標識として発生することが指摘されました。
この表は、ウシ海綿状脳症、古典的および非定型のスクレイピー、および陽性診断のための子宮頸部の慢性消耗性疾患で観察される免疫標識異常プリオンタンパク質タイプの説明と、陰性、不確定、および不適切な結果の確立された基準を要約したものです。すべてのステップは非常に重要です。溶液のpHと室温は、この技術の成功にとって重要な特徴です。
PrPスクレイピーと細胞の種類の両方を検出する免疫組織化学を開発することで、主要な病因に関与する各細胞に関する情報を得ることができます。
