脱细胞软骨细胞外基质水凝胶的合成

我们的方案意义重大，因为它能够在与软骨组织性质非常相似的水凝胶中产生疾病。该技术的主要优点是能够在水凝胶中产生疾病，在空间结构上具有明显的生物活性，免疫原性低，具有生物工业功能。首先，用手术刀将收集的软骨切成一到两立方毫米大小的碎片。

在50毫米离心管中，将20克碎软骨浸入20毫升低渗Tris-盐酸盐缓冲液中。将管子在 80 摄氏度下放置三个小时，然后在 37 摄氏度的烤箱中放置三个小时。以 1000 RPM 涡旋离心管 30 秒。

然后使用放置在50毫升离心管上的塑料筛过滤脱细胞软骨。在收集软骨之前，用无菌PBS洗涤软骨三次。向收集的软骨中加入10毫升胰蛋白酶溶液，在37摄氏度的振荡器上孵育24小时，每4小时更换一次胰蛋白酶。

过滤悬浮液后，用高渗缓冲液洗涤胰蛋白酶消化软骨。保留软骨后，加入 10 毫升核酸酶溶液，并将其放在 37 摄氏度的摇床上 4 小时。用无菌PBS洗涤后，向软骨中加入高渗Tris-hydrochloride溶液，并将其放置在振荡器上，如图所示。

用无菌PBS洗涤后，将组织浸入1%Triton X-100溶液中24小时。取出Triton X-100后，用蒸馏水冲洗脱细胞软骨三天，每12小时换一次水。三天后，在软骨中加入过氧乙酸溶液，浸泡四小时。

用PBS洗涤后，如前所述，使用塑料筛收集软骨。使用液氮，制备脱细胞软骨粉。在两克软骨粉中加入80毫升0.5摩尔醋酸和20毫克胃蛋白酶，在37摄氏度下消化24小时。

消化后，将悬浮液以 400 G 离心 10 分钟并收集上清液，现在称为 DC-ECM 溶液 为了储存 DC-ECM 溶液，向六孔板的每个孔中加入 1 毫升溶液，并将其放入冻干机中。溶液冷冻干燥后，将其转移到离心管中。要形成水凝胶，将 20 毫克冻干的 DC-ECM 溶液溶解在一毫升无菌蒸馏水中。

涡旋后，向 DC-ECM 溶液中加入 1 毫克维生素 B2。孵育后，用紫外线照射三分钟。将缓冲液 GTL 和蛋白酶 K 加入 20 毫克 DC-ECM 软骨粉中，并使用涡旋振荡充分混合。

为了完全溶解软骨，将混合物在 56 摄氏度下孵育 4 小时。涡旋后，加入 200 微升缓冲液 GTL，然后加入无水乙醇。涡旋后，将样品在4摄氏度下以6000G离心一分钟。

然后按照手稿中的描述收集并定量DNA。为了分析胶原蛋白，将 5 毫克 DC-ECM 粉末在 100 摄氏度的盐酸中酸化 20 分钟。然后用五毫升六摩尔氢氧化钠溶液中和。

使用570纳米处的吸光度与羟脯氨酸标准品计算中和样品的羟脯氨酸含量。混合后，将 500 微升试剂 A 加入 200 毫克 DC-ECM 粉末中。将样品在 4 摄氏度下孵育 16 小时。

离心后，收集 50 微升样品溶液并加入 50 微升试剂 B，然后加入试剂 C.将样品孵育 10 分钟后，加入 750 微升试剂 D，在黑暗中孵育 30 分钟。离心后，向沉淀中加入一微升试剂E，并在离心前充分混合。然后在GAG含量测量之前解离样品。

在制备的DC-ECM软骨中，DNA含量被显著消除。然而，与天然软骨相比，胶原蛋白和GAG含量被保留。SEM和TEM分析证明了所制备的DC-ECM的超超结构。

倒置管中制备的水凝胶没有流到底部，从而证明凝胶化。此外，与仅 DC-ECM 溶液相比，由于 DC-ECM 水凝胶形成过程中诱导的交联，添加维生素 B2 缩短了凝胶时间。DC-ECM水凝胶黏度高于溶液黏度，剪切速率增加，溶液黏度降低。

此外，DC-ECM溶液和水凝胶的高储能模量表明它们都具有凝胶而不是液体特性。SEM分析表明，交联和冷冻干燥后，DC-ECM溶液在水凝胶形态中的孔径显著减小。该协议涉及物理和化学破坏以及酶消化的组合，以去除细胞物质，同时保留ECM的结构和对话。