Наш протокол важен тем, что он позволяет создавать заболевания в гидрогелях, которые очень похожи на природу хрящевой ткани. Основным преимуществом данной методики является способность вызывать заболевание в гидрогелях с выраженной биологической активностью в пространственной структуре, низкой иммуногенностью и биологической промышленной функцией. Для начала измельчите собранный хрящ с помощью скальпеля на кусочки размером от одного до двух кубических миллиметров.
В 50-миллиметровую центрифужную пробирку погрузите 20 грамм измельченного хряща в 20 миллилитров гипотонического трис-гидрохлоридного буфера. Поставьте трубку при температуре 80 градусов Цельсия на три часа, а затем в духовку при температуре 37 градусов Цельсия на три часа. Вкрутите пробирку центрифуги в течение 30 секунд при 1000 об/мин.
Затем отфильтруйте децеллюляризованный хрящ с помощью пластикового сита, помещенного на 50-миллилитровую центрифужную пробирку. Трижды промойте хрящ стерильным PBS перед сбором. Добавьте к собранному хрящу 10 миллилитров раствора трипсина и инкубируйте его на шейкере при температуре 37 градусов Цельсия в течение 24 часов, заменяя трипсин каждые четыре часа.
После фильтрации суспензии трипсинизированный хрящ промывают гипертоническим буфером. Как только хрящ сохранится, добавьте 10 миллилитров раствора нуклеазы и поместите его в шейкер при температуре 37 градусов Цельсия на четыре часа. После промывки стерильным PBS добавьте гипертонический раствор трис-гидрохлорида к хрящу и поместите его на шейкер, как показано на рисунке.
После мытья стерильным PBS погрузите салфетку в 1%-ный раствор Triton X-100 на 24 часа. После удаления Triton X-100 промывайте децеллюляризованный хрящ дистиллированной водой в течение трех дней, меняя воду каждые 12 часов. Через трое суток добавьте к хрящу раствор надуксусной кислоты и замочите его на четыре часа.
После промывки PBS соберите хрящ с помощью пластикового сита, как показано ранее. Используя жидкий азот, приготовьте децеллюляризованный хрящевой порошок. Добавьте 80 миллилитров 0,5 молярной уксусной кислоты и 20 миллиграммов пепсина к двум граммам хрящевого порошка и переваривайте смесь в течение 24 часов при температуре 37 градусов по Цельсию.
После разложения центрифугируют суспензию при 400 G в течение 10 минут и собирают надосадочную жидкость, которая теперь называется раствором DC-ECM Для хранения раствора DC-ECM добавьте по одному миллилитру раствора в каждую лунку шестилуночной пластины и поместите его в лиофилизатор. После сублимационной сушки раствора перелейте его в центрифужную пробирку. Для образования гидрогеля растворите 20 миллиграмм лиофилизированного раствора DC-ECM в одном миллилитре стерильной дистиллированной воды.
После вихря добавьте один миллиграмм витамина B2 в раствор DC-ECM. После инкубации облучайте его ультрафиолетовым светом в течение трех минут. Добавьте буферный GTL и протеиназу K к 20 миллиграммам хрящевого порошка DC-ECM и тщательно перемешайте, используя вихревые колебания.
Для полного растворения хряща выдерживайте смесь при температуре 56 градусов Цельсия в течение четырех часов. После вихря добавьте 200 микролитров буферного GTL, а затем безводный этанол. После вихревого центрифугирования образец центрифугируют при 6000 G в течение одной минуты при температуре четыре градуса Цельсия.
Затем соберите и количественно определите ДНК, как описано в рукописи. Для анализа коллагена подкислите пять миллиграммов порошка DC-ECM в соляной кислоте при температуре 100 градусов Цельсия в течение 20 минут. Затем нейтрализуйте его пятью миллилитрами шестимолярного раствора гидроксида натрия.
Рассчитайте содержание гидроксипролина в нейтрализованном образце, используя абсорбцию на длине волны 570 нм по сравнению со стандартом гидроксипролина. Добавьте 500 микролитров реагента А в 200 миллиграмм порошка DC-ECM после смешивания. Инкубируйте образец при температуре четыре градуса Цельсия в течение 16 часов.
После центрифугирования соберите 50 микролитров раствора пробы и добавьте 50 микролитров реагента B, а затем реагента C. После инкубации образца в течение 10 минут добавьте 750 микролитров реагента D и инкубируйте в течение 30 минут в темноте. После центрифугирования добавьте в гранулу один микролитр реагента Е и хорошо перемешайте перед центрифугированием. Затем диссоциируют образец перед измерением содержания ГАГ.
В подготовленном хряще DC-ECM содержание ДНК было значительно исключено. Тем не менее, содержание коллагена и ГАГ было сохранено по сравнению с нативным хрящом. Анализ SEM и TEM продемонстрировал ультраструктуру подготовленного DC-ECM.
Приготовленный гидрогель в перевернутой трубке не стекал на дно, тем самым демонстрируя гелеобразование. Кроме того, по сравнению с раствором только DC-ECM, добавление витамина B2 сокращало время гелеобразования из-за индуцированного сшивания во время образования гидрогеля DC-ECM. Вязкость гидрогеля DC-ECM была выше, чем вязкость раствора, а увеличение скорости сдвига снижало вязкость раствора.
Кроме того, высокий модуль аккумуляции раствора DC-ECM и гидрогеля указывал на то, что они оба обладают гелевыми, а не жидкими свойствами. Анализ СЭМ показал, что размер пор раствора DC-ECM значительно уменьшился в гидрогелевой форме после сшивания и сублимационной сушки. Протокол включает в себя комбинацию физических и химических нарушений и ферментативного расщепления для удаления клеточного материала с сохранением структуры и диалога ECM.
