脱細胞化軟骨細胞外マトリックスハイドロゲルの合成

私たちのプロトコルは、軟骨組織の性質によく似たハイドロゲルで疾患を作り出すことを可能にするという点で重要です。この技術の主な利点は、空間構造において明らかな生物活性、低い免疫原性、および生物学的産業機能を有するハイドロゲル中で疾患を産生する能力である。まず、採取した軟骨をメスで1〜2立方ミリメートルの大きさに切り刻みます。

50ミリメートルの遠心チューブに、みじん切りにした軟骨20グラムを20ミリリットルの低張塩酸トリス緩衝液に浸します。チューブを摂氏80度で3時間置き、次に摂氏37度のオーブンで3時間置きます。遠心分離管を1000RPMで30秒間ボルテックスします。

次に、50ミリリットルの遠心分離管に置かれたプラスチックふるいを使用して脱細胞化軟骨をろ過します。軟骨を採取する前に滅菌PBSで3回洗浄します。採取した軟骨に10ミリリットルのトリプシン溶液を加え、摂氏37度のシェーカーで24時間インキュベートし、4時間ごとにトリプシンを交換します。

懸濁液を濾過した後、トリプシン処理軟骨を高張緩衝液で洗浄する。軟骨が保存されたら、10ミリリットルのヌクレアーゼ溶液を加え、摂氏37度のシェーカーに4時間置きます。滅菌PBSで洗浄した後、高張塩酸トリス溶液を軟骨に加え、図のようにシェーカーの上に置きます。

滅菌PBSで洗浄したら、組織を1%Triton X-100溶液に24時間浸します。Triton X-100を取り外した後、脱細胞化軟骨を蒸留水で3日間すすぎ、12時間ごとに水を交換します。3日後、軟骨に過酢酸溶液を加え、4時間浸します。

PBSで洗浄したら、前述のようにプラスチックふるいを使用して軟骨を採取します。液体窒素を用いて、脱細胞化軟骨粉末を調製する。2グラムの軟骨粉末に80ミリリットルの0.5モル酢酸と20ミリグラムのペプシンを加え、摂氏37度で24時間混合物を消化します。

消化後、懸濁液を400Gで10分間遠心分離し、上清を回収し、現在はDC-ECM溶液と呼ばれていますDC-ECM溶液を保存するには、6ウェルプレートの各ウェルに1ミリリットルの溶液を加え、凍結乾燥機に入れます。溶液が凍結乾燥したら、遠心チューブに移します。ヒドロゲルを形成するには、20ミリグラムの凍結乾燥DC-ECM溶液を1ミリリットルの滅菌蒸留水に溶解します。

ボルテックスしたら、1ミリグラムのビタミンB2をDC-ECM溶液に加えます。インキュベーション後、UV光を3分間照射します。緩衝液GTLとプロテイナーゼKを20ミリグラムのDC-ECM軟骨粉末に添加し、渦振動を用いて十分に混合します。

軟骨を完全に溶解させるには、混合物を摂氏56度で4時間インキュベートします。ボルテックスしたら、200マイクロリットルの緩衝液GTLを加え、続いて無水エタノールを加えます。ボルテックス後、サンプルを6000 Gで摂氏4度で1分間遠心分離します。

次に、原稿に記載されているようにDNAを収集して定量します。コラーゲンを分析するには、5ミリグラムのDC-ECM粉末を塩酸中で摂氏100度で20分間酸性化します。次に、5ミリリットルの6モルの水酸化ナトリウム溶液で中和します。

中和したサンプルのヒドロキシプロリン含有量を、ヒドロキシプロリン標準試料に対して 570 ナノメートルの吸光度を使用して計算します。混合後、500マイクロリットルの試薬Aを200ミリグラムのDC-ECM粉末に加えます。サンプルを摂氏4度で16時間インキュベートします。

遠心分離したら、サンプル溶液の50マイクロリットルを収集し、試薬Bの50マイクロリットルを追加し、試薬C.Afterサンプルを10分間インキュベートした後、試薬Dの750マイクロリットルを追加し、暗闇で30分間インキュベートします。遠心分離後、1マイクロリットルの試薬Eをペレットに加え、遠心分離前によく混合します。次に、GAG含有量測定の前にサンプルを解離します。

調製したDC-ECM軟骨では、DNA含量が有意に除去された。しかし、コラーゲンとGAGの含有量は、天然の軟骨と比較して保持されていました。SEMおよびTEM分析により、準備されたDC-ECMの超微細構造が実証されました。

逆チューブで調製したヒドロゲルは底部に流れず、ゲル化を示しました。さらに、DC-ECMのみの溶液と比較して、ビタミンB2の添加は、DC-ECMヒドロゲル形成中の誘導架橋によるゲル化時間を短縮した。DC-ECMハイドロゲルの粘度は溶液粘度よりも高く、せん断速度の増加により溶液粘度が低下しました。

さらに、DC-ECM溶液とヒドロゲルの高い貯蔵弾性率は、どちらも液体ではなくゲルの特性を持っていることを示しました。SEM分析により、DC-ECM溶液の細孔径は、架橋および凍結乾燥後のヒドロゲル形態で有意に減少することが実証されました。このプロトコルでは、物理的および化学的破壊と酵素消化を組み合わせて、ECMの構造と会話を維持しながら細胞物質を除去します。