당사의 프로토콜은 연골 조직의 특성과 매우 유사한 하이드로겔에서 질병을 생성할 수 있다는 점에서 중요합니다. 이 기술의 주요 장점은 공간 구조에서 명백한 생물학적 활성, 낮은 면역원성 및 생물학적 산업 기능을 가진 하이드로겔에서 질병을 생성할 수 있다는 것입니다. 먼저 채취한 연골을 메스를 사용하여 1-2입방밀리미터 크기로 자른다.
50mm 원심분리 튜브에 다진 연골 20g을 저긴장성 트리스-하이드로클로라이드 완충액 20ml에 담그십시오. 튜브를 섭씨 80도에서 3시간 동안 놓은 다음 섭씨 37도의 오븐에서 3시간 동안 굽습니다. 1000RPM에서 30초 동안 원심분리기 튜브를 소용돌이칩니다.
그런 다음 50밀리리터 원심분리 튜브에 놓인 플라스틱 체를 사용하여 탈세포화된 연골을 여과합니다. 연골을 채취하기 전에 멸균 PBS로 연골을 세 번 씻으십시오. 채취한 연골에 트립신 용액 10mL를 넣고 섭씨 37도의 셰이커에서 24시간 동안 배양하고 4시간마다 트립신을 교체합니다.
현탁액을 여과한 후 트립신화된 연골을 고긴장성 완충액으로 세척합니다. 연골이 보존되면 뉴클레아제 용액 10mL를 넣고 섭씨 37도의 셰이커에 4시간 동안 올려 놓습니다. 멸균 PBS로 세척한 후 연골에 고긴장성 트리스-하이드로클로라이드 용액을 첨가하고 설명과 같이 셰이커에 놓습니다.
멸균 PBS로 세척한 후 조직을 1% Triton X-100 용액에 24시간 동안 담그십시오. Triton X-100을 제거한 후 탈세포화된 연골을 증류수로 3일 동안 헹구고 12시간마다 물을 교체합니다. 3일 후 연골에 과초산 용액을 넣고 4시간 동안 담가둔다.
PBS로 세척한 후 이전에 설명한 대로 플라스틱 체를 사용하여 연골을 수집합니다. 액체 질소를 사용하여 탈세포화된 연골 분말을 준비합니다. 연골 분말 2g에 0.5몰 아세트산 80mL와 펩신 20mg을 넣고 섭씨 37도에서 24시간 동안 혼합물을 소화시킵니다.
분해 후 현탁액을 400G에서 10분 동안 원심분리하고 현재 DC-ECM 용액이라고 하는 상층액을 수집합니다 DC-ECM 용액을 보관하기 위해 6웰 플레이트의 각 웰에 용액 1밀리리터를 추가하고 동결건조기에 넣습니다. 용액이 동결 건조되면 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 하이드로겔을 형성하려면 동결 건조된 DC-ECM 용액 20mg을 멸균 증류수 1mL에 용해시킵니다.
소용돌이가 생기면 DC-ECM 용액에 비타민 B2 1mg을 첨가합니다. 배양 후 3 분 동안 자외선을 조사합니다. DC-ECM 연골 분말 20mg에 완충액 GTL 및 단백질 분해 효소 K를 첨가하고 와류 진동을 사용하여 완전히 혼합합니다.
연골을 완전히 용해시키려면 혼합물을 섭씨 56도에서 4시간 동안 배양합니다. 소용돌이가 발생하면 200마이크로리터의 완충액 GTL을 첨가한 다음 무수 에탄올을 추가합니다. 와류 후 샘플을 섭씨 4도에서 1분 동안 6000G로 원심분리합니다.
그런 다음 원고에 설명된 대로 DNA를 수집하고 정량화합니다. 콜라겐 분석을 위해 DC-ECM 분말 5mg을 염산에서 섭씨 100도에서 20분 동안 산성화합니다. 그런 다음 5 밀리리터의 6 몰 수산화 나트륨 용액으로 중화시킵니다.
하이드록시프롤린 표준물질에 대해 570나노미터에서 흡광도를 사용하여 중화된 샘플의 하이드록시프롤린 함량을 계산합니다. 혼합 후 500 마이크로 리터의 시약 A를 200 밀리그램의 DC-ECM 분말에 첨가합니다. 샘플을 섭씨 4도에서 16시간 동안 배양합니다.
원심분리가 완료되면 50 마이크로 리터의 샘플 용액을 수집하고 50 마이크로 리터의 시약 B를 첨가 한 다음 시약 C를 첨가합니다.샘플을 10 분 동안 배양 한 후 750 마이크로 리터의 시약 D를 추가하고 어두운 곳에서 30 분 동안 배양합니다. 원심분리 후 펠릿에 시약 E 1마이크로리터를 넣고 원심분리하기 전에 잘 혼합합니다. 그런 다음 GAG 함량 측정 전에 샘플을 해리합니다.
제조된 DC-ECM 연골에서, DNA 함량은 현저하게 제거되었다. 그러나 콜라겐과 GAG 함량은 천연 연골에 비해 유지되었습니다. SEM 및 TEM 분석은 준비된 DC-ECM의 초구조를 시연했습니다.
역관에서 제조된 하이드로겔은 바닥으로 흐르지 않아 겔화를 나타낸다. 또한, DC-ECM 단독 용액에 비해 비타민 B2를 첨가하면 DC-ECM 하이드로겔 형성 시 유도된 가교에 의한 겔화 시간이 단축되었습니다. DC-ECM 하이드로겔 점도는 용액 점도보다 높았으며, 전단 속도가 증가하면 용액 점도가 감소하였다.
또한, DC-ECM 용액과 하이드로겔의 높은 저장 탄성률은 둘 다 액체가 아닌 겔 특성을 가지고 있음을 나타냅니다. SEM 분석은 가교 및 동결 건조 후 하이드로겔 형태에서 DC-ECM 용액의 공극 크기가 현저히 감소했음을 입증했습니다. 이 프로토콜은 ECM의 구조와 대화를 보존하면서 세포 물질을 제거하기 위한 물리적, 화학적 파괴와 효소 분해의 조합을 포함합니다.
