Nuestro protocolo es importante, ya que permite la creación de enfermedades en hidrogeles que se asemejan mucho a la naturaleza del tejido cartilaginoso. La principal ventaja de esta técnica es la capacidad de producir enfermedad en hidrogeles con evidente actividad biológica en estructura espacial, baja inmunogenicidad y función biológica industrial. Para empezar, corta el cartílago recogido con un bisturí en trozos de uno a dos milímetros cúbicos.
En un tubo de centrífuga de 50 milímetros, sumerja 20 gramos del cartílago picado en 20 mililitros de tampón hipotónico de triclorhidrato. Coloque el tubo a 80 grados centígrados durante tres horas y luego en el horno a 37 grados centígrados durante tres horas. Agite el tubo de la centrífuga durante 30 segundos a 1000 RPM.
A continuación, filtre el cartílago descelularizado con un tamiz de plástico colocado en un tubo de centrífuga de 50 mililitros. Lave el cartílago tres veces con PBS estéril antes de recogerlo. Añadir 10 mililitros de solución de tripsina al cartílago recogido e incubarlo en un agitador a 37 grados centígrados durante 24 horas, sustituyendo la tripsina cada cuatro horas.
Después de filtrar la suspensión, lavar el cartílago tripsinizado con tampón hipertónico. Una vez conservado el cartílago, añadir 10 mililitros de solución de nucleasa y colocarlo en una coctelera a 37 grados centígrados durante cuatro horas. Después de lavar con PBS estéril, agregue una solución hipertónica de clorhidrato de Tris al cartílago y colóquela en el agitador como se demuestra.
Una vez lavado con PBS estéril, sumerja el tejido en una solución de Triton X-100 al 1% durante 24 horas. Después de retirar el Triton X-100, enjuague el cartílago descelularizado con agua destilada durante tres días, cambiando el agua cada 12 horas. Después de tres días, agregue la solución de ácido peracético al cartílago y déjelo en remojo durante cuatro horas.
Una vez lavado con PBS, recoger el cartílago utilizando un colador de plástico como se ha demostrado anteriormente. Con nitrógeno líquido, prepare el cartílago descelularizado en polvo. Agregue 80 mililitros de ácido acético 0.5 molar y 20 miligramos de pepsina a dos gramos de cartílago en polvo, y digiera la mezcla durante 24 horas a 37 grados centígrados.
Después de la digestión, centrifugue la suspensión a 400 G durante 10 minutos y recoja el sobrenadante, que ahora se llama solución DC-ECM Para almacenar la solución DC-ECM, agregue un mililitro de la solución a cada pocillo de una placa de seis pocillos y colóquela en un liofilizador. Una vez que la solución esté liofilizada, transfiérala a un tubo de centrífuga. Para formar un hidrogel, disuelva 20 miligramos de solución DC-ECM liofilizada en un mililitro de agua destilada estéril.
Una vez en vórtice, agregue un miligramo de vitamina B2 a la solución DC-ECM. Después de la incubación, irradiarlo con luz ultravioleta durante tres minutos. Agregue tampón GTL y proteinasa K a 20 miligramos de polvo de cartílago DC-ECM y mezcle bien usando oscilación de vórtice.
Para la disolución completa del cartílago, incubar la mezcla a 56 grados centígrados durante cuatro horas. Una vez en vórtice, agregue 200 microlitros de tampón GTL seguido de etanol anhidro. Después del vórtice, centrifugar la muestra a 6000 G durante un minuto a cuatro grados centígrados.
A continuación, recoja y cuantifique el ADN como se describe en el manuscrito. Para analizar el colágeno, acidifique cinco miligramos de polvo DC-ECM en ácido clorhídrico a 100 grados centígrados durante 20 minutos. Luego neutralícelo con cinco mililitros de solución de hidróxido de sodio de seis molares.
Calcule el contenido de hidroxiprolina de la muestra neutralizada utilizando la absorbancia a 570 nanómetros en comparación con el estándar de hidroxiprolina. Agregue 500 microlitros de reactivo A a 200 miligramos de polvo DC-ECM después de mezclar. Incubar la muestra a cuatro grados centígrados durante 16 horas.
Una vez centrifugada, recoja 50 microlitros de solución de muestra y agregue 50 microlitros de reactivo B, seguido del reactivo C. Después de incubar la muestra durante 10 minutos, agregue 750 microlitros de reactivo D e incube durante 30 minutos en la oscuridad. Después de la centrifugación, agregue un microlitro del reactivo E al gránulo y mezcle bien antes de centrifugar. A continuación, disocie la muestra antes de la medición del contenido de GAG.
En el cartílago DC-ECM preparado, el contenido de ADN se eliminó significativamente. Sin embargo, el contenido de colágeno y GAG se mantuvo en comparación con el cartílago nativo. El análisis SEM y TEM demostró la ultraestructura del DC-ECM preparado.
El hidrogel preparado en el tubo invertido no fluyó hacia el fondo, lo que demuestra la gelificación. Además, en comparación con la solución DC-ECM sola, la adición de vitamina B2 redujo el tiempo de gelificación debido a la reticulación inducida durante la formación del hidrogel DC-ECM. La viscosidad del hidrogel DC-ECM fue mayor que la viscosidad de la solución y el aumento de las velocidades de cizallamiento disminuyó la viscosidad de la solución.
Además, el alto módulo de almacenamiento de la solución DC-ECM y el hidrogel indicaba que ambos tenían propiedades de gel en lugar de líquidas. El análisis SEM demostró que el tamaño de los poros de la solución DC-ECM disminuyó significativamente en la forma de hidrogel después de la reticulación y la liofilización. El protocolo implica una combinación de disrupción física y química y digestión enzimática para eliminar el material celular mientras se preserva la estructura y la conversación de la MEC.
