从肺源性样品中分离和纯化微血管和大血管内皮细胞

该协议与从组织样本或非常小的血管碎片中分离内皮细胞有关。该技术的主要优点是它可以在任何研究实验室中复制，并且即使从非常小的样品中也可以获得良好纯度的内皮细胞。通过在含有不含氯化钙和氯化镁或PBS减去的PBS的50毫升管中洗涤收集的样品来开始制备肺实质样品。

将样品转移到无菌培养皿中，并使用手术剪刀手动切成约三到四毫米的小碎片。对于动脉段，在含有PBS减去的50毫升管中洗涤收集的样品，并将其转移到无菌培养皿中而不切碎。为了去除大部分残留血液，给予两次PBS冲洗减去切块的肺实质或肺动脉段。

接下来，将样品放入 15 毫升管中，并与 5 毫升 II 型胶原酶在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下孵育 10 分钟。要去除大碎片，请将无菌的一毫米网目大小的过滤器放在 50 毫升收集管的顶部，并将 15 毫升管中的所有内容物倒入过滤器上。接下来，用刮刀轻轻按摩消化的组织，然后用PBS减去冲洗样品，直到收集管充满。

为了去除非血管内皮细胞，使用70微米网眼大小的细胞过滤器过滤从新鲜的50毫升管中收集的消化细胞的流出。然后使用40微米网目大小的细胞过滤器，将流出量收集在标记为管1的新鲜50毫升管中。在室温下以30 G离心样品五分钟以沉淀细胞簇。

使用无菌移液管将上清液转移到标记为管2的新鲜50毫升管中。将颗粒悬浮在管 1 中，并用 PBS 减去负值填充管子最多 50 毫升。同样，用 PBS 减去负值填充管 2 最多 50 毫升。

完成后，在室温下以300 G离心样品五分钟。用两毫升生长培养基悬浮沉淀，并将悬浮液接种在预编码的六孔板的两个独立孔中。观察到部分处理的细胞聚集体，包括平滑肌细胞或SMC和成纤维细胞，与长纤维结合。

此外，SMC代表了大多数非血细胞单细胞。直径不超过10至20微米的小型紧凑细胞簇没有可归因于基质组织碎片的元素。获得了大约70%纯的人肺微血管内皮细胞或HLMVEC单细胞。

在获得纯HLMVEC制剂的同时，分选的细胞呈现出特征性的内皮样形状。局灶显微镜显示，几乎100%的脂肪纯化细胞对内皮细胞抗原染色呈阳性，即CD31和更特异性的血管性血友病因子。当这些细胞坐在基质胶中时，它们产生管状结构和HUVEC，确认它们的内皮表型。

由于酶消化过程中的孵育时间短，因此预热胶原酶很重要。另一点是，在细胞簇沉降过程中，重要的是在不接触托盘中的细胞聚集体的情况下轻轻去除上清液。该程序基于离心和过滤的使用，因此可以提供新的见解，以了解根据其特征（例如大小和聚类）分离其他细胞类型。