هذا البروتوكول مناسب لعزل الخلايا البطانية من عينات الأنسجة أو قطع صغيرة جدا من الأوعية الدموية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكن استنساخها في أي مختبر أبحاث وتسمح بالحصول على نقاء جيد للخلايا البطانية ، حتى من عينات صغيرة جدا. ابدأ في تحضير عينة حمة الرئة عن طريق غسل العينات التي تم جمعها في أنبوب سعة 50 ملليلتر يحتوي على برنامج تلفزيوني بدون كلوريد الكالسيوم وكلوريد المغنيسيوم ، أو PBS ناقص ناقص.
انقل العينات إلى طبق بتري معقم واقطعها يدويا إلى شظايا صغيرة من حوالي ثلاثة إلى أربعة ملليمترات باستخدام مقص جراحي. بالنسبة لجزء الشريان ، اغسل العينات التي تم جمعها في أنبوب سعة 50 ملليلتر يحتوي على برنامج تلفزيوني ناقص ناقص ، وانقله إلى طبق بتري معقم دون تقطيع. لإزالة الجزء الكبير من الدم المتبقي ، أعط غسلتين من PBS ناقص إلى حمة الرئة مكعبات أو جزء الشريان الرئوي.
بعد ذلك ، ضع العينات في أنابيب سعة 15 ملليلتر واحتضانها بخمسة ملليلتر من كولاجيناز النوع الثاني لمدة 10 دقائق عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. لإزالة الشظايا الكبيرة ، ضع مصفاة معقمة بحجم شبكة ملليمتر واحد على الجزء العلوي من أنبوب التجميع سعة 50 ملليلتر واسكب المحتويات بالكامل من الأنبوب سعة 15 ملليلتر على المصفاة. بعد ذلك ، قم بتدليك الأنسجة المهضومة برفق باستخدام ملعقة قبل شطف العينة باستخدام PBS ناقص ناقص حتى يتم ملء أنبوب التجميع.
لإزالة الخلايا البطانية غير الوعائية، قم بتصفية التدفق الخارجي الذي تم جمعه من الخلايا المهضومة في أنبوب جديد سعة 50 ملليلترا باستخدام مصفاة خلوية بحجم شبكة 70 ميكرومتر. ثم باستخدام مصفاة خلية بحجم شبكة 40 ميكرومتر ، اجمع التدفق الخارجي في أنبوب جديد سعة 50 ملليلتر يسمى الأنبوب 1. أجهزة الطرد المركزي العينات في 30 G لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة لترسيب مجموعات الخلايا.
استخدم ماصة معقمة لنقل المادة الطافية إلى أنبوب جديد سعة 50 ملليلتر يسمى الأنبوب 2. الحبيبات في الأنبوب 1 واملأ الأنبوب حتى 50 ملليلتر مع طرح PBS ناقص. وبالمثل ، املأ الأنبوب 2 حتى 50 ملليلتر مع PBS ناقص ناقص.
بمجرد الانتهاء من ذلك ، قم بطرد العينات عند 300 جرام لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. الكريات بمليلتر من وسط النمو وزرع المعلق في بئرين منفصلين من صفيحة ستة آبار مشفرة مسبقا. وقد لوحظ أن جزءا من مجاميع الخلايا المعالجة ، بما في ذلك خلايا العضلات الملساء أو SMCs والخلايا الليفية ، كانت مرتبطة بألياف طويلة.
أيضا ، تمثل SMCs غالبية المفردات غير خلايا الدم. كانت مجموعات صغيرة مدمجة من الخلايا بأقطار لا تتجاوز 10 إلى 20 ميكرومتر بدون عناصر تعزى إلى شظايا الأنسجة اللحمية. تم الحصول على ما يقرب من 70٪ من الخلايا البطانية الوعائية الدقيقة للرئة البشرية النقية ، أو HLMVEC ، خلايا مفردة.
أثناء الحصول على مستحضرات HLMVEC النقية ، افترضت الخلايا المصنفة الشكل الشبيه بالبطانة المميزة. أظهر الفحص المجهري البؤري أن ما يقرب من 100٪ من الخلايا النقية للدهون ملطخة إيجابية لمستضدات الخلايا البطانية ، وهي CD31 وعامل فون ويلبراند الأكثر تحديدا. عندما كانت هذه الخلايا تجلس في matrigel ، فإنها تولد هياكل أنبوبية و HUVECs ، مما يؤكد النمط الظاهري البطاني.
بسبب وقت الحضانة القصير أثناء الهضم الأنزيمي ، من المهم تسخين الكولاجيناز. ونقطة أخرى هي أنه أثناء ترسيب مجموعات الخلايا ، من المهم إزالة المادة الطافية برفق دون لمس مجاميع الخلايا في البليت. يعتمد هذا الإجراء على استخدام الطرد المركزي والترشيح ، وبالتالي يمكن أن يوفر رؤية جديدة لمعرفة فصل أنواع الخلايا الأخرى على أساس خصائصها ، مثل الحجم والتجميع.
