Этот протокол актуален для выделения эндотелиальных клеток из образцов тканей или очень маленьких кусочков кровеносных сосудов. Основным преимуществом этого метода является то, что он может быть воспроизведен в любой исследовательской лаборатории и позволяет получить хорошую чистоту эндотелиальных клеток даже из очень маленьких образцов. Начните подготовку образца паренхимы легких с промывки собранных образцов в 50-миллилитровой пробирке, содержащей PBS без хлорида кальция и хлорида магния или PBS минус минус.
Переложите образцы в стерильную чашку Петри и измельчите вручную на мелкие фрагменты размером около трех-четырех миллиметров с помощью хирургических ножниц. Для сегмента артерии вымойте собранные образцы в 50-миллилитровой пробирке, содержащей PBS минус минус, и перенесите ее в стерильную чашку Петри, не измельчая. Чтобы удалить большую часть остаточной крови, дайте две промывки PBS минус минус нарезанной кубиками паренхиме легкого или сегменту легочной артерии.
Затем поместите образцы в 15-миллилитровые пробирки и инкубируйте с пятью миллилитрами коллагеназы II типа в течение 10 минут при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа. Чтобы удалить крупные фрагменты, поместите стерильное ситечко размером в один миллиметр на верхнюю часть 50-миллилитровой сборной пробирки и вылейте все содержимое из 15-миллилитровой пробирки на сетчатое фильтр. Затем аккуратно помассируйте переваренную ткань шпателем, прежде чем промыть образец PBS минус минус до тех пор, пока пробирка для сбора не будет заполнена.
Чтобы удалить несосудистые эндотелиальные клетки, отфильтруйте отток, собранный из переваренных клеток, в свежую 50-миллилитровую пробирку с помощью клеточного сетчатого фильтра размером 70 микрометров. Затем, используя сетчатый фильтр размером с ячейку размером 40 микрометров, соберите отток в свежую 50-миллилитровую пробирку, помеченную как пробирка 1. Центрифугируют образцы при 30 г в течение пяти минут при комнатной температуре, чтобы осадить кластеры клеток.
Используйте стерильную пипетку для переноса надосадочной жидкости в свежую 50-миллилитровую пробирку, помеченную как пробирка 2. Суспендируйте гранулы в тубу 1 и заполните пробирку до 50 миллилитров PBS минус минус. Точно так же заполните тюбик 2 до 50 миллилитров PBS минус минус.
После этого центрифугируйте образцы при 300 г в течение пяти минут при комнатной температуре. Суспендируйте гранулы с двумя миллилитрами питательной среды и засейте суспензию в две отдельные лунки предварительно закодированной шестилуночной пластины. Было замечено, что часть обработанных клеточных агрегатов, включая гладкомышечные клетки или SMC и фибробласты, были связаны с длинными волокнами.
Кроме того, SMC представляли собой большинство синглетов, не относящихся к клеткам крови. Небольшие компактные скопления клеток диаметром не более 10-20 микрометров не содержали элементов, относимых к фрагментам стромальной ткани. Было получено около 70% чистых микрососудистых эндотелиальных клеток легких человека, или HLMVEC, одиночных клеток.
При получении чистых препаратов HLMVEC отсортированные клетки приобретали характерную эндотелиоподобную форму. Фокальная микроскопия показала, что почти 100% очищенных клеток жира окрашены положительно на антигены эндотелиальных клеток, а именно CD31 и более специфический фактор фон Виллебранда. Когда эти клетки были помещены в матригель, они генерировали канальцевые структуры и HUVEC, подтверждая их эндотелиальный фенотип.
Из-за короткого времени инкубации во время ферментативного пищеварения важно предварительно подогреть коллагеназу. И еще один момент заключается в том, что во время осаждения клеточных кластеров важно аккуратно удалить надосадочную жидкость, не задевая клеточные агрегаты в поддоне. Эта процедура основана на использовании центрифугирования и фильтрации и, следовательно, может дать новое понимание того, как разделять другие типы клеток на основе их характеристик, таких как размер и кластеризация.
