Este protocolo es relevante para el aislamiento de células endoteliales de muestras de tejido o trozos muy pequeños de vasos sanguíneos. La principal ventaja de esta técnica es que se puede reproducir en cualquier laboratorio de investigación y permite obtener una buena pureza de las células endoteliales, incluso a partir de muestras muy pequeñas. Comience a preparar la muestra de parénquima pulmonar lavando las muestras recolectadas en un tubo de 50 mililitros que contenga PBS sin cloruro de calcio y cloruro de magnesio, o PBS menos menos.
Transfiera las muestras a una placa de Petri estéril y córtelas manualmente en pequeños fragmentos de aproximadamente tres a cuatro milímetros usando tijeras quirúrgicas. Para el segmento arterial, lave las muestras recolectadas en un tubo de 50 mililitros que contenga PBS menos menos y transfiéralas a una placa de Petri estéril sin cortar. Para eliminar la mayor parte de la sangre residual, dé dos lavados de PBS menos menos el parénquima pulmonar cortado en cubitos o el segmento de la arteria pulmonar.
A continuación, coloque las muestras en tubos de 15 mililitros e incube con cinco mililitros de colagenasa tipo II durante 10 minutos a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono. Para eliminar los fragmentos grandes, coloque un colador estéril del tamaño de una malla de un milímetro en la parte superior del tubo de recolección de 50 mililitros y vierta todo el contenido del tubo de 15 mililitros en el filtro. A continuación, masajee suavemente el tejido digerido con una espátula antes de enjuagar la muestra con PBS menos menos hasta que se llene el tubo de recolección.
Para eliminar las células endoteliales no vasculares, filtre el flujo de salida recogido de las células digeridas en un tubo fresco de 50 mililitros utilizando un colador celular del tamaño de una malla de 70 micrómetros. Luego, usando un colador celular del tamaño de una malla de 40 micrómetros, recoja el flujo de salida en un tubo fresco de 50 mililitros etiquetado como Tubo 1. Centrifugar las muestras a 30 G durante cinco minutos a temperatura ambiente para sedimentar los grupos de células.
Use una pipeta estéril para transferir el sobrenadante a un tubo fresco de 50 mililitros etiquetado como Tubo 2. Suspenda el pellet en el tubo 1 y llene el tubo hasta 50 mililitros con PBS menos menos. Del mismo modo, llene el tubo 2 hasta 50 mililitros con PBS menos menos.
Una vez hecho esto, centrifugar las muestras a 300 G durante cinco minutos a temperatura ambiente. Suspender los gránulos con dos mililitros de medio de cultivo y sembrar la suspensión en dos pocillos separados de una placa de seis pocillos precodificada. Se observó que parte de los agregados celulares tratados, incluidas las células musculares lisas o SMC y fibroblastos, estaban unidos a fibras largas.
Además, los SMC representaban la mayoría de los singletes de células no sanguíneas. Los pequeños grupos compactos de células con diámetros no superiores a 10 a 20 micrómetros carecían de elementos atribuibles a fragmentos de tejido estromal. Se obtuvieron aproximadamente 70% de células endoteliales microvasculares de pulmón humano puro, o HLMVEC, células individuales.
Al obtener preparaciones puras de HLMVEC, las células clasificadas asumieron la forma endotelial característica. En microscopía focal mostró que casi el 100% de las células purificadas de la grasa se tiñeron positivas para antígenos de células endoteliales, a saber, CD31 y el factor de von Willebrand más específico. Cuando estas células se asentaron en matrigel, generaron estructuras tubulares y HUVECs, confirmando su fenotipo endotelial.
Debido al corto tiempo de incubación durante la digestión enzimática, es importante precalentar la colagenasa. Y otro punto es que durante la sedimentación de los grupos celulares, es importante eliminar suavemente el sobrenadante sin tocar los agregados celulares en la paleta. Este procedimiento se basa en el uso de centrifugación y filtraciones, y por lo tanto podría proporcionar nuevos conocimientos para saber separar otros tipos de células en función de sus características, como el tamaño y la agrupación.
