Ce protocole est pertinent pour l’isolement de cellules endothéliales à partir d’échantillons de tissus ou de très petits morceaux de vaisseaux sanguins. Le principal avantage de cette technique est qu’elle peut être reproduite dans n’importe quel laboratoire de recherche et qu’elle permet d’obtenir une bonne pureté des cellules endothéliales, même à partir de très petits échantillons. Commencez à préparer l’échantillon de parenchyme pulmonaire en lavant les échantillons prélevés dans un tube de 50 millilitres contenant du PBS sans chlorure de calcium et chlorure de magnésium, ou PBS moins moins.
Transférer les échantillons dans une boîte de Petri stérile et hacher manuellement en petits fragments d’environ trois à quatre millimètres à l’aide de ciseaux chirurgicaux. Pour le segment des artères, lavez les échantillons prélevés dans un tube de 50 millilitres contenant du PBS moins moins et transférez-les dans une boîte de Petri stérile sans hachage. Pour enlever la grande partie du sang résiduel, donnez deux lavages de PBS moins moins au parenchyme pulmonaire coupé en dés ou au segment de l’artère pulmonaire.
Ensuite, placez les échantillons dans des tubes de 15 millilitres et incuber avec cinq millilitres de collagénase de type II pendant 10 minutes à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone. Pour retirer les gros fragments, placez une crépine stérile d’un millimètre sur le dessus du tube collecteur de 50 millilitres et versez tout le contenu du tube de 15 millilitres sur la passoire. Ensuite, massez doucement le tissu digéré avec une spatule avant de rincer l’échantillon avec PBS moins moins jusqu’à ce que le tube de collecte soit rempli.
Pour éliminer les cellules endothéliales non vasculaires, filtrez le flux sortant recueilli des cellules digérées dans un nouveau tube de 50 millilitres à l’aide d’une crépine cellulaire de 70 micromètres. Ensuite, à l’aide d’une crépine à cellules de 40 micromètres de la taille d’un maillage, collectez le débit sortant dans un nouveau tube de 50 millilitres étiqueté comme tube 1. Centrifuger les échantillons à 30 G pendant cinq minutes à température ambiante pour sédimenter les amas cellulaires.
Utilisez une pipette stérile pour transférer le surnageant dans un nouveau tube de 50 millilitres étiqueté tube 2. Suspendez la pastille dans le tube 1 et remplissez le tube jusqu’à 50 millilitres avec PBS moins moins. De même, remplissez le tube 2 jusqu’à 50 millilitres avec PBS moins moins.
Une fois cela fait, centrifuger les échantillons à 300 G pendant cinq minutes à température ambiante. Suspendre les pastilles avec deux millilitres de milieu de croissance et ensemencer la suspension dans deux puits distincts d’une plaque précodée à six puits. Il a été observé qu’une partie des agrégats cellulaires traités, y compris les cellules musculaires lisses ou SMC et fibroblastes, étaient liés à de longues fibres.
De plus, les CMS représentaient la majorité des singulets non sanguins. De petits amas compacts de cellules dont le diamètre ne dépasse pas 10 à 20 micromètres étaient dépourvus d’éléments attribuables à des fragments de tissu stromal. Environ 70% de cellules endothéliales microvasculaires pulmonaires humaines pures, ou HLMVEC, ont été obtenues.
Tout en obtenant des préparations HLMVEC pures, les cellules triées ont pris la forme endothéliale caractéristique. La microscopie focale a montré que près de 100% des cellules purifiées de la graisse étaient colorées positives pour les antigènes des cellules endothéliales, à savoir CD31 et le facteur de von Willebrand plus spécifique. Lorsque ces cellules étaient assises dans un matrigel, elles généraient des structures tubulaires et des HUVEC, confirmant leur phénotype endothélial.
En raison du court temps d’incubation pendant la digestion enzymatique, il est important de préchauffer la collagénase. Et un autre point est que lors de la sédimentation des amas cellulaires, il est important d’enlever délicatement le surnageant sans toucher aux agrégats cellulaires dans la palette. Cette procédure est basée sur l’utilisation de la centrifugation et des filtrations, et pourrait donc fournir de nouvelles informations à savoir pour séparer d’autres types de cellules sur la base de leurs caractéristiques, telles que la taille et le clustering.
