פרוטוקול זה רלוונטי לבידוד תאי אנדותל מדגימות רקמה או מחתיכות קטנות מאוד של כלי דם. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן לשכפל אותה בכל מעבדת מחקר והיא מאפשרת להשיג טוהר טוב של תאי אנדותל, אפילו מדגימות קטנות מאוד. התחל להכין את דגימת פרנכימת הריאה על ידי שטיפת הדגימות שנאספו בצינור 50 מיליליטר המכיל PBS ללא סידן כלורי ומגנזיום כלורי, או PBS מינוס מינוס.
מעבירים את הדגימות לצלחת פטרי סטרילית וקוצצים ידנית לשברים קטנים של כשלושה עד ארבעה מילימטרים באמצעות מספריים כירורגיים. עבור קטע העורק, לשטוף את הדגימות שנאספו בצינור 50 מיליליטר המכיל PBS מינוס מינוס, ולהעביר אותו לתוך צלחת פטרי סטרילי ללא קיצוץ. כדי להסיר את החלק הגדול של הדם שיורית, לתת שתי שטיפות של PBS מינוס מינוס parenchyma ריאות קצוץ או קטע עורק ריאתי.
לאחר מכן, מניחים את הדגימות בצינורות 15 מיליליטר ודגרים עם חמישה מיליליטר של collagenase מסוג II במשך 10 דקות ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני. כדי להסיר את השברים הגדולים, הניחו מסננת סטרילית בגודל רשת של מילימטר אחד על החלק העליון של צינור האיסוף של 50 מיליליטר ושפכו את כל התוכן מצינור ה-15 מיליליטר על המסננת. לאחר מכן, לעסות בעדינות את הרקמה המעוכלת עם מרית לפני שטיפת הדגימה עם PBS מינוס מינוס עד צינור האיסוף מלא.
כדי להסיר תאי אנדותל שאינם וסקולריים, סנן את הזרימה החוצה שנאספה מתאים מעוכלים בצינור טרי של 50 מיליליטר באמצעות מסננת תאים בגודל רשת של 70 מיקרומטר. לאחר מכן באמצעות מסננת תאים בגודל רשת של 40 מיקרומטר, אספו את הזרימה החוצה בצינור טרי של 50 מיליליטר המסומן כצינור 1. צנטריפוגה את הדגימות ב 30 G במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר כדי לשקוע אשכולות התא.
השתמשו בפיפט סטרילי כדי להעביר את הסופרנאטנט לצינור טרי של 50 מיליליטר המסומן כצינור 2. להשעות את הגלולה בצינור 1 ולמלא את הצינור עד 50 מיליליטר עם PBS מינוס מינוס. באופן דומה, מלא צינור 2 עד 50 מיליליטר עם PBS מינוס מינוס.
לאחר שתסיים, צנטריפוגר את הדגימות ב 300 G במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. להשעות את הכדוריות עם שני מיליליטר של מדיום צמיחה ולזרוע את ההשעיה בשתי בארות נפרדות של צלחת שש בארות מקודדת מראש. נצפה כי חלק מצברי התאים שטופלו, כולל תאי השריר החלק או SMCs ופיברובלסטים, היו קשורים לסיבים ארוכים.
כמו כן, SMCs ייצגו את רוב הסינגלטים שאינם תאי דם. אשכולות קומפקטיים קטנים של תאים בקוטר שלא יעלה על 10 עד 20 מיקרומטר היו ללא אלמנטים המיוחסים לשברי רקמת סטרומה. התקבלו כ-70% תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים טהורים של הריאה האנושית, או HLMVEC, תאים בודדים.
בעת קבלת תכשירי HLMVEC טהורים, התאים הממוינים קיבלו את הצורה האופיינית דמוית אנדותל. במיקרוסקופ מוקדי הראו כי כמעט 100% מהתאים המטוהרים של השומן הוכתמו חיוביים לאנטיגנים של תאי אנדותל, כלומר CD31 וגורם פון וילברנד הספציפי יותר. כאשר תאים אלה ישבו במטריג'ל, הם יצרו מבנים צינוריים ו- HUVECs, המאשרים את פנוטיפ האנדותל שלהם.
בשל זמן הדגירה הקצר במהלך העיכול האנזימטי, חשוב לחמם מראש את collagenase. נקודה נוספת היא שבמהלך שיקוע של צבירי תאים, חשוב להסיר בעדינות את הסופרנאטנט מבלי לגעת בצברי התאים במשטח. הליך זה מבוסס על שימוש בצנטריפוגות וסינון, ולכן יכול לספק תובנה חדשה לדעת להפריד בין סוגי תאים אחרים על בסיס המאפיינים שלהם, כגון גודל ואשכולות.
