Bu protokol, endotel hücrelerinin doku örneklerinden veya çok küçük kan damarlarından izolasyonu ile ilgilidir. Bu tekniğin temel avantajı, herhangi bir araştırma laboratuvarında çoğaltılabilmesi ve çok küçük örneklerden bile endotel hücrelerinin iyi bir saflığının elde edilmesini sağlamasıdır. Toplanan örnekleri kalsiyum klorür ve magnezyum klorür içermeyen PBS veya PBS eksi eksi içeren 50 mililitrelik bir tüpte yıkayarak akciğer parankim örneğini hazırlamaya başlayın.
Numuneleri steril bir Petri kabına aktarın ve cerrahi makas kullanarak yaklaşık üç ila dört milimetrelik küçük parçalar halinde manuel olarak doğrayın. Arter segmenti için, toplanan numuneleri PBS eksi eksi içeren 50 mililitrelik bir tüpte yıkayın ve doğrama yapmadan steril bir Petri kabına aktarın. Artık kanın büyük bir kısmını çıkarmak için, doğranmış akciğer parankimine veya pulmoner arter segmentine eksi iki PBS eksi yıkama verin.
Daha sonra, numuneleri 15 mililitrelik tüplere yerleştirin ve 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte 10 dakika boyunca beş mililitre tip II kollajenaz ile inkübe edin. Büyük parçaları çıkarmak için, 50 mililitrelik toplama tüpünün üstüne steril bir milimetrelik ağ boyutunda bir süzgeç yerleştirin ve 15 mililitrelik tüpün tüm içeriğini süzgecin üzerine dökün. Daha sonra, toplama tüpü dolana kadar numuneyi PBS eksi eksi ile durulamadan önce sindirilmiş dokuya bir spatula ile hafifçe masaj yapın.
Vasküler olmayan endotel hücrelerini çıkarmak için, sindirilmiş hücrelerden toplanan çıkışı, 70 mikrometrelik ağ boyutunda bir hücre süzgeci kullanarak 50 mililitrelik taze bir tüpte filtreleyin. Daha sonra 40 mikrometrelik ağ boyutunda bir hücre süzgeci kullanarak, çıkışı Tüp 1 olarak etiketlenmiş 50 mililitrelik yeni bir tüpte toplayın. Hücre kümelerini çökeltmek için numuneleri oda sıcaklığında beş dakika boyunca 30 G'de santrifüj edin.
Süpernatantı Tüp 2 olarak etiketlenmiş 50 mililitrelik yeni bir tüpe aktarmak için steril bir pipet kullanın. Peletleri Tüp 1'de askıya alın ve tüpü PBS eksi eksi ile 50 mililitreye kadar doldurun. Benzer şekilde, Tüp 2'yi 50 mililitreye kadar PBS eksi eksi ile doldurun.
Tamamlandığında, numuneleri oda sıcaklığında beş dakika boyunca 300 G'de santrifüj edin. Peletleri iki mililitre büyüme ortamı ile askıya alın ve süspansiyonu önceden kodlanmış altı delikli bir plakanın iki ayrı kuyucuğuna tohumlayın. Düz kas hücreleri veya SMC'ler ve fibroblastlar dahil olmak üzere tedavi edilen hücre agregalarının bir kısmının uzun liflere bağlandığı gözlenmiştir.
Ayrıca, SMC'ler kan hücresi dışı bekarların çoğunluğunu temsil ediyordu. Çapları 10 ila 20 mikrometreyi geçmeyen küçük kompakt hücre kümeleri, stromal doku parçalarına atfedilebilecek elementlerden yoksundu. Yaklaşık %70 oranında saf insan akciğer mikrovasküler endotel hücreleri veya HLMVEC, tek hücreler elde edildi.
Saf HLMVEC preparatları elde edilirken, sıralanan hücreler karakteristik endotel benzeri şekli aldı. Fokal mikroskopide, yağın saflaştırılmış hücrelerinin neredeyse% 100'ünün endotel hücre antijenleri, yani CD31 ve daha spesifik von Willebrand faktörü için pozitif boyandığı gösterilmiştir. Bu hücreler matrigel içine oturtulduklarında, endotel fenotiplerini doğrulayan tübüler yapılar ve HUVEC'ler ürettiler.
Enzimatik sindirim sırasında kısa inkübasyon süresi nedeniyle, kollajenazı önceden ısıtmak önemlidir. Ve başka bir nokta, hücre kümelerinin çökelmesi sırasında, paletteki hücre agregalarına dokunmadan süpernatantın nazikçe çıkarılmasının önemli olmasıdır. Bu prosedür, santrifüjleme ve filtrasyonların kullanımına dayanır ve bu nedenle, diğer hücre tiplerini, boyut ve kümeleme gibi özelliklerine göre ayırmayı bilmek için yeni bilgiler sağlayabilir.
