Dieses Protokoll ist relevant für die Isolierung von Endothelzellen aus Gewebeproben oder sehr kleinen Stücken von Blutgefäßen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie in jedem Forschungslabor reproduziert werden kann und es ermöglicht, auch aus sehr kleinen Proben eine gute Reinheit der Endothelzellen zu erhalten. Beginnen Sie mit der Vorbereitung der Lungenparenchymprobe, indem Sie die gesammelten Proben in einem 50-Milliliter-Röhrchen waschen, das PBS ohne Calciumchlorid und Magnesiumchlorid oder PBS minus minus enthält.
Übertragen Sie die Proben in eine sterile Petrischale und zerkleinern Sie sie manuell mit einer chirurgischen Schere in kleine Fragmente von etwa drei bis vier Millimetern. Für den Arterienabschnitt werden die gesammelten Proben in einem 50-Milliliter-Röhrchen mit PBS minus minus minus gewaschen und ohne Zerkleinern in eine sterile Petrischale überführt. Um den größten Teil des Restblutes zu entfernen, geben Sie zwei Waschungen PBS minus minus auf das gewürfelte Lungenparenchym oder das Pulmonalarteriensegment.
Anschließend werden die Proben in 15-Milliliter-Röhrchen gegeben und mit fünf Millilitern Kollagenase Typ II 10 Minuten bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid inkubiert. Um die großen Bruchstücke zu entfernen, legen Sie ein steriles Sieb von einem Millimeter Maschenweite auf die Oberseite des 50-Milliliter-Auffangröhrchens und gießen Sie den gesamten Inhalt aus dem 15-Milliliter-Röhrchen auf das Sieb. Massieren Sie anschließend das verdaute Gewebe vorsichtig mit einem Spatel, bevor Sie die Probe mit PBS minus minus spülen, bis das Sammelröhrchen gefüllt ist.
Um nicht-vaskuläre Endothelzellen zu entfernen, filtern Sie den Abfluss aus verdauten Zellen in einem frischen 50-Milliliter-Röhrchen mit einem Zellsieb von 70 Mikrometern Maschenweite. Sammeln Sie dann mit einem 40-Mikrometer-Sieb den Abfluss in einem frischen 50-Milliliter-Röhrchen, das als Röhrchen 1 gekennzeichnet ist. Zentrifugieren Sie die Proben bei 30 G für fünf Minuten bei Raumtemperatur, um die Zellcluster zu sedimentieren.
Verwenden Sie eine sterile Pipette, um den Überstand in ein frisches 50-Milliliter-Röhrchen zu überführen, das als Röhrchen 2 gekennzeichnet ist. Suspendieren Sie das Pellet in Röhrchen 1 und füllen Sie das Röhrchen bis zu 50 Milliliter mit PBS minus Minus. Füllen Sie Tube 2 ebenfalls bis zu 50 Milliliter mit PBS minus minus.
Anschließend zentrifugieren Sie die Proben bei 300 G für fünf Minuten bei Raumtemperatur. Suspendieren Sie die Pellets mit zwei Millilitern Wachstumsmedium und säen Sie die Suspension in zwei separate Vertiefungen einer vorcodierten Sechs-Well-Platte. Es wurde beobachtet, dass ein Teil der behandelten Zellaggregate, einschließlich der glatten Muskelzellen oder SMCs und Fibroblasten, an lange Fasern gebunden war.
Außerdem stellten SMCs die Mehrheit der Nicht-Blutzell-Singuletts dar. Kleine, kompakte Zellhaufen mit Durchmessern von nicht mehr als 10 bis 20 Mikrometern waren ohne Elemente, die auf Fragmente von Stromagewebe zurückzuführen waren. Es wurden etwa 70 % reine humane mikrovaskuläre Endothelzellen der Lunge, kurz HLMVEC, Einzelzellen erhalten.
Bei der Gewinnung reiner HLMVEC-Präparate nahmen die sortierten Zellen die charakteristische endotheliale Form an. Die fokale Mikroskopie zeigte, dass fast 100% der gereinigten Zellen des Fettes positiv für Endothelzellantigene, nämlich CD31 und den spezifischeren von-Willebrand-Faktor, gefärbt wurden. Wenn diese Zellen in Matrigel saßen, erzeugten sie röhrenförmige Strukturen und HUVECs, was ihren endothelialen Phänotyp bestätigte.
Aufgrund der kurzen Inkubationszeit während des enzymatischen Aufschlusses ist es wichtig, die Kollagenase vorzuwärmen. Ein weiterer Punkt ist, dass es bei der Sedimentation von Zellclustern darauf ankommt, den Überstand schonend zu entfernen, ohne die Zellaggregate in der Palette zu berühren. Dieses Verfahren basiert auf dem Einsatz von Zentrifugation und Filtration und könnte daher neue Erkenntnisse liefern, um andere Zelltypen anhand ihrer Eigenschaften wie Größe und Clusterbildung zu unterscheiden.
