Este protocolo é relevante para o isolamento de células endoteliais a partir de amostras de tecido ou pedaços muito pequenos de vasos sanguíneos. A principal vantagem desta técnica é que ela pode ser reproduzida em qualquer laboratório de pesquisa e permite obter uma boa pureza de células endoteliais, mesmo a partir de amostras muito pequenas. Comece a preparar a amostra de parênquima pulmonar lavando as amostras coletadas em um tubo de 50 mililitros contendo PBS sem cloreto de cálcio e cloreto de magnésio, ou PBS menos menos.
Transfira as amostras para uma placa de Petri estéril e pique manualmente em pequenos fragmentos de cerca de três a quatro milímetros usando tesoura cirúrgica. Para o segmento arterial, lavar as amostras coletadas em um tubo de 50 mililitros contendo PBS menos e transferi-las para uma placa de Petri estéril sem picar. Para remover a grande parte do sangue residual, dê duas lavagens de PBS menos para o parênquima pulmonar cortado em cubos ou o segmento da artéria pulmonar.
Em seguida, coloque as amostras em tubos de 15 mililitros e incube com cinco mililitros de colagenase tipo II por 10 minutos a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Para remover os grandes fragmentos, coloque um filtro estéril de um milímetro do tamanho de uma malha na parte superior do tubo de coleta de 50 mililitros e despeje todo o conteúdo do tubo de 15 mililitros no filtro. Em seguida, massageie suavemente o tecido digerido com uma espátula antes de enxaguar a amostra com PBS menos menos até que o tubo de coleta esteja cheio.
Para remover células endoteliais não vasculares, filtre o fluxo coletado das células digeridas em um tubo fresco de 50 mililitros usando um filtro de células de 70 micrômetros do tamanho de uma malha. Em seguida, usando um filtro de células do tamanho de uma malha de 40 micrômetros, colete o fluxo de saída em um tubo fresco de 50 mililitros rotulado como Tubo 1. Centrifugar as amostras a 30 G durante cinco minutos à temperatura ambiente para sedimentar os aglomerados celulares.
Use uma pipeta estéril para transferir o sobrenadante para um tubo fresco de 50 mililitros rotulado como Tubo 2. Suspenda o pellet no tubo 1 e encha o tubo até 50 mililitros com PBS menos menos. Da mesma forma, encha o tubo 2 até 50 mililitros com PBS menos menos.
Uma vez feito, centrifugar as amostras a 300 G por cinco minutos à temperatura ambiente. Suspender os pellets com dois mililitros de meio de crescimento e semear a suspensão em dois poços separados de uma placa pré-codificada de seis poços. Observou-se que parte dos agregados celulares tratados, incluindo as células musculares lisas ou SMCs e fibroblastos, estavam ligados a fibras longas.
Além disso, as CMEs representaram a maioria dos singletes não sanguíneos. Pequenos aglomerados compactos de células com diâmetros não superiores a 10 a 20 micrômetros estavam sem elementos atribuíveis a fragmentos de tecido estromal. Aproximadamente 70% de células endoteliais microvasculares pulmonares humanas puras, ou HLMVEC, foram obtidas.
Durante a obtenção de preparações puras de HLMVEC, as células classificadas assumiram a forma endotelial característica. A microscopia focal mostrou que quase 100% das células purificadas da gordura foram positivas para antígenos de células endoteliais, ou seja, CD31 e o fator de von Willebrand, mais específico. Quando essas células foram assentadas em matrigel, geraram estruturas tubulares e HUVECs, confirmando seu fenótipo endotelial.
Devido ao curto tempo de incubação durante a digestão enzimática, é importante pré-aquecer a colagenase. E outro ponto é que durante a sedimentação dos aglomerados celulares, é importante remover suavemente o sobrenadante sem tocar nos agregados celulares do palete. Esse procedimento é baseado no uso de centrifugação e filtração e, portanto, pode fornecer uma nova visão para saber separar outros tipos de células com base em suas características, como tamanho e agrupamento.
